[发明专利]一种低毒的Kdo2‑单磷酸类脂A的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型低毒的Kdo₂-单磷酸类脂A的制备及其应用，属于生物工程领域。

背景技术

脂多糖(LPS)，即细菌内毒素，是构成大多数革兰氏阴性细菌外膜外层的主要成分，主要由Kdo₂-类脂A(Kdo₂-Lipid A)，核心多糖(Core)和O-抗原(O-antigen)三部分组成；其中Kdo₂-类脂A是LPS的疏水端，其结构非常保守，连接着亲水的核心多糖和O-抗原并协助二者粘附于细胞表面构成完整细胞壁。革兰氏阴性菌侵入宿主后会释放其表层的LPS，LPS可以被宿主免疫细胞表面的Toll样受体4(Toll Like Receptor 4，TLR-4)识别，继而引发细胞内一系列的生理生化反应，产生TNF-α、IL-6、IL-8等多种炎性细胞因子。其中，Kdo₂-类脂A是与TLR-4受体结合的主要部分，尤其是类脂A部分的精细结构决定了LPS刺激细胞后释放的细胞因子种类和数量。

野生型大肠杆菌和沙门氏菌的类脂A部分一般包含六条或七条脂肪酸链并在C1位和C4’位连有两个磷酸基团，具有较高的细胞毒性。而某些特殊结构的类脂A衍生物，则显示出较低的毒性，可作为疫苗佐剂，非特异性地增强机体对抗原的免疫应答反应，提高疫苗效率。但，由于类脂A分子水溶性非常低，在水相中不能展现有效的生物活性，所以近几十年至今，基础科研或者临床上还是使用LPS粗样来对相应的类脂A衍生物生物活性进行研究，但LPS由于核心糖及O抗原部分结构多样化，分子量大且不均一，无法通过质谱或核磁共振的方法进行实时检测和快速鉴定，也暂无标准化的提取纯化方法。此外，目前生产类脂A所采用的沙门氏菌是致病菌且合成多种不同结构类脂A，操作起来比较困难、产品不纯且在水相体系生物活性不佳，还需吸附在某些盐表面才能与疫苗结合而更好的作用；实际生产过程中涉及到酸/碱水解等多种化学处理，步骤繁多、成本高，而且在处理过程中会伴随脂肪酸链的断裂，破坏化合物有效结构，影响产品质量和产量。

大肠杆菌W3110是非致病菌，其LPS部分不包含O-抗原，只有Kdo₂-类脂A与核心多糖，且其Kdo₂-类脂A部分结构单一，只包含两个2-酮-3-脱氧辛酸、六条脂肪酸链和C1、C4’位两个磷酸基团，从细胞内膜内侧开始合成，合成途径非常保守，因此大肠杆菌W3110是优于沙门氏菌的工业生产出发菌株。而Kdo₂-类脂A相对类脂A具有更好的双亲性，易于直接提取和纯化，又能被ESI质谱直接检测鉴定，在水相体系也具有较好的溶解度和生物活性。本发明改造大肠杆菌，合成了一种具有特殊结构、低毒的Kdo₂-单磷酸类脂A，这种Kdo₂- 单磷酸类脂A不含核心多糖长链、仅由两个2-酮-3-脱氧辛酸、六条脂肪酸链和C4’位单个磷酸基团构成。这种特别的Kdo₂-单磷酸类脂A，便于分离提取和检测，工业化生产效率高、成本低，且这种特别的Kdo₂-单磷酸类脂A化合物保持了类脂A部分的有效的免疫刺激活性，较野生型W3110的LPS也有明显的减毒作用，是极具发展潜力的疫苗佐剂。同时，本发明提供一种提取和纯化Kdo₂-类脂A的标准化方法，步骤简单明了，易于操作。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种具有特殊结构、减毒的Kdo₂-单磷酸类脂A，其化学式为C₁₁₀H₂₀₁N₂O₃₆P，相对分子质量为2157.37，是以β-(1’-6)连接的D-葡萄糖胺二糖为骨架，6’位连接二α-酮基-3-脱氧-D-甘露辛酸(Kdo₂)、4’位被磷酸化、3’位连接(R)-3-(十四烷氧基)十四烷基、2’位氨基连接(R)-3-(十二烷氧基)十四烷基、3位和2位氨基分别连接十四烷氧基而构成，具体结构式如式I所示：