[发明专利]小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体多肽片段的DNA核酸适体

说明书

技术领域

本发明涉及化学生物学技术领域，更具体地说是涉及小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体多肽片段的DNA核酸适体的序列筛选。

背景技术

核酸适体(Aptamers)是从大容量的随机寡核苷酸序列库中针对非核酸靶分子选择得到的能与该靶分子高亲合度高特异性结合的单链DNA或RNA分子，是通过体外重复的吸附、恢复、再放大过程，从而实现对与靶分子相结合的寡核苷酸序列的指数富集而得到的。这种选择核酸适体的方法叫SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，通过指数富集对配体的系统进化)，在1990年分别由Tuerk and Gold(文献：C.Tuerk,L.Gold,Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase,Science,1990,249:505-510)以及Ellington and Szostak(文献：A.D.Ellington,J.W.Szostak,In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands,Nature 1990,346:818-822)两个研究小组独立报导。核酸适体除了具有与抗体相似的对靶分子的高亲合度和高特异性结合外，还具有如下抗体所不具备的优点：1)容易生产，生产周期短；2)靶分子适应范围宽：核酸适体的靶分子包括各种蛋白质(酶、膜蛋白、病毒蛋白、细胞因子和生长因子、免疫球蛋白等)、氨基酸、药物、金属离子、其他生物/无机/有机小分子、以及整个细胞，而抗体只能被用于免疫源性化合物；3)生产成本低；4)易于修饰；5)化学稳定性以及热稳定性强，储存寿命长。核酸适体自出现以后，就得到了各个领域的广泛关注，特别是近年来在生物传感器、新药开发等领域的应用取得了一定的成果。最近，小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体(pro-gastrin-releasing peptide，Pro-GRP(1–98a.a.))的DNA核酸适体被报道(M.Mie,T.Kai1,T.Le,A.E.G.Cass,E.Kobatake,Selection of DNA aptamers with affinity for pro-gastrin-releasing peptide(proGRP),a tumor marker for small cell lung cancer,Applied Biochemistry and Biotechnology,2013,169:250-255)。Pro-GRP是一种小细胞肺癌肿瘤标志物。研究表明，Pro-GRP的活性位点位于其31-98a.a，因而，Pro-GRP的31-98a.a.多肽片段(Pro-GRP_31-98)是一种新的、敏感、特异、可靠的小细胞肺癌肿瘤标志物。目前未见筛选Pro-GRP_31-98的DNA核酸适体序列的相关报道。

发明内容

本发明目的在于提供针对Pro-GRP_31-98的DNA核酸适体序列，为后期生物传感器、临床诊断试剂研发提供方便。

为实现本目的，本发明通过基于亲和磁珠分离法的SELEX筛选方法，从单链DNA(ssDNA)文库中筛选出Pro-GRP_31-98的DNA核酸适体文库，然后对筛选出的DNA适体文库经聚合酶链式反应(PCR)扩增后，以大肠杆菌为受体细胞通过基因克隆技术对DNA适体文库中的DNA核酸适体进行分离，通过测序技术确定各条DNA核酸适体的序列，最后通过电化学发光(ECL)法，以[Ru(bpy)₂dppz]²⁺为DNA分子开关和ECL试剂，对各条DNA核酸适体针对Pro-GRP_31-98的结合特异性和结合力进行分析检测，确定针对Pro-GRP_31-98的高亲和力、特异性DNA核酸适体序列。

原理及具体技术方案如下：

SELEX筛选过程由构建DNA文库、孵育、分离和PCR扩增四个步骤组成。其中孵育、分离和PCR扩增步骤交替重复12次。构建的DNA文库序列为：5'-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-(48nt)-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3'。