[发明专利]检测RET基因M918T位点突变的引物、试剂盒及其PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测RET基因M918T位点突变的引物、试剂盒及其PCR方法，用于RET基因M918T位点突变的快速检测。

背景技术

多发性内分泌腺瘤2型（multiple endocrine neoplasia type 2，MEN2）是一种以甲状腺、肾上腺髓质和甲状旁腺内神经内分泌细胞发生增生或肿瘤为主要特征的常染色体显性遗传病，临床上分为MEN2A、MEN2B和家族性甲状腺髓样癌三个亚型，MEN2A主要累及甲状腺C细胞、肾上腺髓质和甲状旁腺，分别表现为甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤和甲状旁腺功能亢进；MEN2B主要表现为甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤和口唇舌和胃肠道神经瘤和马凡综合征体型。

MEN2由原癌基因RET突变引起，该基因位于染色体10q11.2上，其编码蛋白RET是与细胞膜结合的酪氨酸激酶受体，转导某些组织发育（包括由神经嵴发育而来的组织）的生长和分化信号，RET基因的某些突变激活RET激酶活性，引起肿瘤发生或转化。

临床证据表明，RET基因突变多发生于第10外显子上的609、611、618、620和第11外显子的634编码子，其中后者突变最常见，约占MEN-2A的85%～87%，而且超过90%的多发性内分泌腺瘤2型的发生与RET基因的M918T突变密切相关。通过RET基因突变筛查，可早期发现患病基因型携带者，进行有效的干预治疗，从而改变临床病程，改善预后，RET基因突变的筛查已成为遗传研究的一个典型。

目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法；PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP；PCR高分辨熔解曲线分析技术；PCR-Taqman MGB（Minor Groove Binder）探针法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。这些方法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。

如：1）直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测基因突变的灵敏度为20%（即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%）。同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易实施等缺点。

2）普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1;14(3):163-9, United States Patent 20120135406]。

3）芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。

4）PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低，但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高昂，普及受限，见[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]。

5）PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见 [J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8):2909-15；United States Patent 20090311679]，并且不能检测样本中的含量较少(≥1,000个中的1个)的等位基因或突变位点。

6）PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染，而且操作步骤多，费时费力。