[发明专利]一种检测HDR盐单胞菌的特异性引物对及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌检测技术领域，特别涉及一种检测HDR盐单胞菌的特异性引物对及其检测方法。

背景技术

油井在生产过程中，随着温度、压力的降低和气体的析出，达到一定条件时，原油中溶解的蜡就会结晶、析出。随着温度、压力的进一步降低，石蜡将不断地析出，其结晶体便聚集和沉淀在油管、套管、抽油杆、抽油泵等管材和设备上，这种现象称为结蜡。油井结蜡会严重影响油田的正常生产，油管壁结蜡会增加对地层的回压，降低油井产量，严重甚至将井筒通道堵死，造成油井停产；油管和抽油杆间的结蜡会增大抽油机载荷，甚至造成抽油泵蜡卡；地层射孔炮眼泵入口处结蜡，会增大油流阻力，降低泵效；油层内部结蜡会大幅度降低其液相渗透率，使油井大幅度减产甚至不出油。

近年来微生物防蜡技术克服了传统防蜡技术的缺点，不会造成地层伤害，不会产生油井怠产，不会污染环境，可广泛应用于各种含蜡油井，是一种新型、经济、环保的油井防蜡技术，因此越来越受到石油工业的重视。该技术针对原油含蜡的特点以及结蜡机理，筛选合适的细菌组合注入井筒，利用微生物及其代谢产物的作用，阻止石蜡结晶，防止或缓解井筒结蜡，达到代替或逐渐替代传统防蜡措施的目的。

在江汉油田、克拉玛依油田、江苏油田近年来油井微生物防蜡技术进行了大规模的推广应用，取得了较好的效果。该技术应用最主要的菌种为盐单胞菌（Halomonas），简称HDR，是微生物防蜡的重要菌种，目前对于这一重要功能菌的检测存在一定的难度。在定量分析方面，目前只能根据不同微生物克隆数通过分子生物学方法确定石油烃降解菌在样品中的相对含量，并结合样品总菌浓（如生物显微镜计数等）进行计算获得，由于油井产出液等环境的待测样品一般包含种类繁多、组成复杂的微生物，而且不同微生物的丰度相差巨大。在采用传统方法分析时，一方面，生物显微镜计数误差较大，且不能做低浓度检测；另一方面，对于丰度低的微生物，在DNA提取分析过程中可能会出现漏检；对于不同生理特性的微生物，往往因为培养条件不适也会造成漏检，同时，传统方法存在着耗时长、过程繁杂等一系列缺陷。

发明内容

本发明的针对现有技术中检测盐单胞菌方法存在的问题，提供一种检测HDR盐单胞菌的特异性引物对，以便于精确检测油田产出液中HDR盐单胞菌的浓度。

本发明的目的这样实现的，一种检测HDR盐单胞菌的特异性引物对， 其特征在于，包括如下正向引物和反向引物：

HaloF: ACGGCATCCGGAACTGTCA

HaloR: TCCGATCCGGACTGAGACC。

本发明还提供一种采用上述特异性引物对检测HDR盐单胞菌浓度的检测方法，包括如下步骤：

（1）提取待测样品中微生物的DNA；

（2）采用上述检测HDR盐单胞菌的特异性引物对，对步骤（1）获得的样品DNA进行荧光定量PCR扩增，读取荧光定量PCR扩增反应的C_T值；

（3）根据公式：C_T = -3.430lg N + 48.28求得步骤1)中待测样品中的石油烃降解菌浓度N。

进一步的，上述荧光定量PCR扩增的反应体系包括如下组分: 9.5 μL无菌水、12.5 μL Universal SYBR Green Master Mix、12.5 μM的正向和反向引物各0.5 μL、2 μL待测样品DNA。

进一步的，所述荧光定量PCR扩增的程序为：a）95 °C保温5 min；b）94 °C保温30 s；c）64°C保温30 s；d）72 °C保温45 s; e）重复执行b）~d）50次；f）从65 °C开始每5 s增加0.5°C至达到95 °C为止。

为准确检测HDR盐单胞菌浓度，所述步骤3）中的公式C_T = -3.430lg N + 48.28通过如下方法拟合：

A）取浓度为3.23×10⁹ cells/mL的石油烃降解菌液100mL，提取菌液中的DNA，溶于无菌水中制得100μL的DNA溶液，然后做10倍梯度的稀释，分别得到浓度为3.23×10⁹、3.23×10⁸、3.23×10⁷、3.23×10⁶、3.23×10⁵、3.23×10⁴、3.23×10³的标准DNA溶液样品；