[发明专利]检测PDGFRA基因D842V多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测PDGFRA基因D842V多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，用于PDGFRA基因D842V多态性位点的快速检测。

背景技术

血小板衍生生长因子（PDGF）是一种促血管生成因子，PDGF是多种间质细胞如成纤维细胞、血管平滑肌细胞、肾小球血管细胞、神经胶质细胞、内皮细胞等的强效促有丝分裂原和重要的血管生长因子，由血小板，组织细胞和某些肿瘤细胞产生。血小板衍生生长因子受体（PDGFR）是一种受体酪氨酸蛋白激酶家族成员，能够促进细胞的趋化、分裂与增殖，在机体生长发育、创伤修复等生理过程中起积极重要的作用，并与肿瘤的发生密切相关。PDGFRA是PDGFR的一种，在促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及血管生成等方面发挥重要作用。PDGFR通路的激活涉及关键的下游信号通路，包括RAS-MAPK途径和PI3K途径等。

PDGFRA基因由人类第4号染色体基因编码（4q12），PDGFRA基因全长约65 kb，由23 个外显子组成，其中外显子3～10编码胞外的5个免疫球蛋白样区域，外显子11编码跨膜区，外显子13～15和外显子17～21分别编码胞内的2个酪氨酸激酶区。PDGFRA基因编码的蛋白质是血小板衍生生长因子受体α（platelet2derived growth factor recep tor alpha，PDGFRA），PDGFRA为一种单链跨膜糖蛋白，由1089个氨基酸组成，593～954位属于酪氨酸激酶区。

PDGFRA基因突变常发生于12号外显子和18号外显子。伊马替尼（格列卫，Gleevec）作用于PDGFR下游的酪氨酸激酶，临床研究显示伊马替尼用于治疗胃肠道间质瘤、脑瘤和黑色素瘤效果显著，但PDGFRA基因外显子18的D842V突变会导致胃肠道间质瘤患者对伊马替尼原发耐药。胃肠道间质瘤患者中约7%的病例携带PDGFR基因突变，其中1/3病例有PDGFRA突变，突变主要发生在编码活性结构域的外显子18上，且PDFGRα基因突变与C-KIT基因突变是相互独立的。选择靶向药物治疗癌症的患者应进行该基因的突变检测，以帮助医生了解患者是否会对单抗类药物产生耐药性。

目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法；PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP；PCR高分辨熔解曲线分析技术；PCR-Taqman MGB（Minor Groove Binder）探针法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。这些方法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。

如：1）直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测基因突变的灵敏度为20%（即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%）。同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易实施等缺点。

2）普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1;14(3):163-9, United States Patent 20120135406]。

3）芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。

4）PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低，但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高昂，普及受限，见[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]。

5）PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见 [J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8):2909-15；United States Patent 20090311679]，并且不能检测样本中的含量较少(≥1,000个中的1个)的等位基因或突变位点。