[发明专利]PSA的ELISA试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及PSA的ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)是与前列腺癌相关的一种抗原，属糖蛋白类物质，分子量约为34KD，pH为6.8～7.5，等电点为6.9，半衰期为2.2士0.8天。PSA存在于前列腺内质网和前列腺上皮细胞及分泌物当中，正常前列腺及病变前列腺组织内均含有PSA。它是公认的诊断前列腺癌的较好的肿瘤标志物，其诊断前列腺癌的特异性为82％-97％。前列腺癌在男性所有类型癌中占10％～20％，是男性最常见的癌肿。该病进展缓慢，是威胁50岁以上男性生命的主要癌症，在西方国家占男性死亡率的第二位。流行病学调查表明，随着我国居民生活水平的改善，环境污染的加剧以及饮食结构的改变，前列腺癌的发病率日趋上升，已引起临床上的高度重视。美国FDA已批准将PSA检测作为50岁以上男性的普查指标。研究显示，PSA测定在早期诊断前列腺癌上要优于直肠指检。正常男性的PSA值<4ug/L。

PSA在血液中以游离和结合两种形式存在。其中游离PSA(free PSA，F-PSA)只占小部分，结合型(comlexed PSA，C-PSA)占大部分，即与内源性蛋白酶抑制物前列腺癌α1-抗糜蛋白酶(α1-antichymotrysin，ACT)结合成PSA-ACT复合物，以及与另一种蛋白抑制物α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin，α2M)结合成PSA-α2M。在精液中，PSA还与C蛋白抑制物构成复合物。由于PSA-α2M不具有免疫活性，不能被现有的PSA检测法检测到。所以目前可定量检测到的PSA有3种：T-PSA(总PSA)，F-PSA,PSA-ACT。

测量血清中总PSA可以用于筛选和早期诊断前列腺癌，它是公认的诊断前列腺癌的较好的肿瘤标志物。研究显示,总PSA测定在早期诊断前列腺癌上要优于直肠指检。美国FDA已批准将总PSA检测作为50岁以上男性的普查指标。使用总PSA作为诊断前列腺癌的诊断标准是：总PSA：0～4ng/ml正常；4～10ng/mL，21～25％的患癌几率；>10ng/ml癌症。在4.0～10ng/ml的灰色区域，单独检测总PSA无法区分癌症和良性增生。游离PSA可提供更好的生化指标，用于区分总PSA4～10ng/ml的前列腺癌和良性增生。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测游离PSA的酶联免疫试剂盒，其由PSA标准品、对照液、游离PSA单克隆抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离PSA单克隆抗体溶液和辅助试剂组成。

在本发明中，包被酶标板的游离PSA单克隆抗体和HRP标记的游离PSA单克隆抗体为配对抗体，并且可通过商业渠道获得。

在本发明的一个实施方案中，所述包被酶标板的制备过程为：将包被用游离PSA单克隆抗体用0.05M碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用0.05M磷酸盐缓冲液(pH值为9.5)洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。所述封闭液为含1g/L的BSA、0.1g/L的蔗糖和0.5g/L的酪蛋白(Casein)的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为9.5。

所述HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的游离PSA单克隆抗体和0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为8.5。

所述辅助试剂包括对照缓冲液、底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液，各试剂具体为：

对照缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；

底物溶液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；

显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；

反应终止液为3mol/L硫酸；

清洗缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。

本发明所述游离PSA的酶联免疫试剂盒的最低检测限可以达到0.1ng/mL PSA，并且稳定性极佳，在室温条件下可保存1年，在4℃下可保存3年。

具体实施方式

下面将结合举例来说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1