[发明专利]表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 201510292896.X | 申请日： | 2015-06-01 |
| 公开（公告）号： | CN105039268A | 公开（公告）日： | 2015-11-11 |
| 发明（设计）人： | 陈柳;张存;倪征;叶伟成;余斌;云涛;华炯钢 | 申请（专利权）人： | 浙江省农业科学院 |
| 主分类号： | C12N7/01 | 分类号： | C12N7/01;C12N15/869;A61K39/295;A61K39/245;A61K39/12;A61P31/14;A61P31/22 |
| 代理公司： | 杭州天勤知识产权代理有限公司 33224 | 代理人： | 胡红娟 |
| 地址： | 310021 *** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 表达 鸭坦布苏 病毒 蛋白 重组 瘟病 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基因，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。
2.如权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述基因组插入有Pcmv-E-BGH-pA表达框；其中E表示鸭坦布苏病毒E蛋白基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；所述基因组中gfp基因的CMV启动子替换为EF1启动子。
3.如权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因插入在所述基因组的US7基因和US8基因之间。
4.如权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，以鸭瘟病毒的疫苗株作为活载体。
5.一种重组鸭瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：
(1)将pDEV-vac中gfp基因的CMV启动子替换成EF1启动子，获得pDEV-EF1；
(2)将Pcmv-E-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1，获得pDEV-E；
(3)将pDEV-E转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒；
其中pDEV-vac为携带鸭瘟病毒疫苗株全基因组的感染性细菌人工染色体克隆，E表示鸭坦布苏病毒E蛋白基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；
所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。
6.如权利5所述的构建方法，其特征在于，所述CMV启动子替换成EF1启动子的方法为：
(1)以pEP-EF1-in为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物，扩增获得目标片段；
(2)将所述目标片段转入pDEV-vac/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanEF1；
(3)敲除pDEV-kanEF1中的kan抗性基因，获得pDEV-EF1；
所述的pDEV-vac/GS1783为携带pDEV-vac的大肠杆菌GS1783。
7.如权利5所述的构建方法，其特征在于，所述Pcmv-E-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1的方法为：
(1)人工合成所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因，插入pEP-BGH-end，获得pEP-BGH-E；
(2)以pEP-BGH-E为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物，扩增获得目标片段；
(3)将所述目标片段转入pDEV-EF1/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanE；
(4)敲除pDEV-kanE中的kan抗性基因，获得pDEV-E。
8.如权利要求1-4任一所述的重组鸭瘟病毒在制备动物疫苗中的应用。
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