[发明专利]假病毒包装系统及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和分子生物学领域，具体涉及假病毒包装载体及包装系统，其用于制备假病毒的用途，以及假病毒的制备方法。

背景技术

假病毒(pseudovirus)是病毒衣壳蛋白或者包膜蛋白包裹携带有报告基因的异源核酸形成的类似于真病毒的具有感染性的病毒颗粒，由于被包裹的核酸不具有复制形成病毒的全部核酸序列的能力，所以假病毒只有一轮的感染力，操作比较安全。

假病毒主要通过多质粒共转染HEK293T或293FT细胞，在细胞内自行复制、表达组装形成，通过收集培养基上清或者裂解细胞等方法获得。

假病毒具备和真病毒一样的感染性，进入细胞的过程和真病毒一样，但其进入细胞后不具有复制产生病毒的能力，因而没有危害，可以更安全地用于中和抗体和抗病毒药物检测。

对传染性强、致病性强的病毒，如SARS-CoV，Ebola病毒，狂犬病毒，H7N9等的研究具有极大的危险性，而且数量有限，而假病毒安全性好，并可以通过转染技术大量制备，为这些危险性高的病毒研究提供了方便。

假病毒体系有多种，主要包括以慢病毒载体构建的假病毒，以病毒蛋白自组装形成的假病毒，以及以病毒基因改造、插入报告基因所形成的假病毒。慢病毒载体是以HIV-1为基础发展起来的，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，可提供所有转录并包装RNA到重组假病毒所需要的全部辅助蛋白，利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒包装，包装好的病毒颗粒分泌到细胞外培养基中。

假病毒体系的特点是克服了传统方法的缺陷，使检测技术更安全、简便、快速、高通量，而且使一些本身很难培养的病毒也能采用培养的方法进行检测。

美国国立卫生研究院(NIH)提供了两个HIV-1为基础的质粒，分别是不携带Fluc基因的pSG3.Δenv和携带Fluc基因的NL4-3.Fluc.R-.E-。种辉辉、聂建辉等利用pSG3.Δenv建立了HIV假病毒检测中和抗体的方法，另外国内外很多研究人员利用NL4-3.Fluc.R-.E-构建了许多假病毒，例如SARS-CoV，Ebola病毒，狂犬病毒，流感病毒等。由于pSG3.Δenv不含报告基因，因此只能用于感染表达荧光素酶的TZM-bl等细胞，限制了假病毒的感染细胞范围；而NL4-3.Fluc.R-.E-可以表达荧光素酶，从而提供检测的信号，但是该质粒用到的启动子为HIV长末端重复序列(LTR)，表达效率较低。

发明内容

本发明提供了一种能够高效表达荧光素酶的假病毒包装载体及包装系统，具体包括以下几个方面。

本发明第一方面涉及一种假病毒包装载体，其是在载体pSG3.Δenv中可操作地连接有荧光素酶基因和调节该基因转录的启动子。

在本发明的一个实施方案中，其是在载体pSG3.Δenv中nef基因的上游可操作地连接有荧光素酶基因和调节该基因转录的启动子。

在本发明的一个实施方案中，其是在载体pSG3.Δenv第11946位至14103之间可操作地连接有荧光素酶基因和调节该基因转录的启动子。

在本发明的一个具体实施方案中，其是在载体pSG3.Δenv第13967处可操作地连接有荧光素酶基因和调节该基因转录的启动子。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的荧光素酶选自萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶。

在本发明的一个具体实施方案中，所述萤火虫荧光素酶基因的序列如SEQ ID NO：3所示。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的启动子为CMV启动子，优选地，所述CMV启动子的序列如SEQ ID NO：18所示。

在本发明的一个实施方案中，其中所述荧光素酶基因和调节该基因转录的启动子的序列如SEQ ID NO：6所示。

在本发明的一个具体实施方案中，所述假病毒包装载体具有如SEQ ID NO：7所示的序列。

本发明另一方面涉及一种假病毒包装系统，其包含本发明第一方面任一项的假病毒包装载体和至少一种真核表达载体。

在本发明的实施方案中其中所述本发明第一方面任一项的假病毒包装载体作为假病毒包装的骨架载体，所述真核表达载体作为假病毒包装的外源基因表达载体。