[发明专利]基于D‑丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

权利要求书

1.一种基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为1A751-pUB-P43-DPE-dal，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2015257。

2.权利要求1所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751 (dal^-)；将来源于梭状芽胞杆菌（Clostridium scindens）ATCC 35704 的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶DPE基因和P43启动子构建至质粒pUB110中得到pUB-P43-DPE；用D-丙氨酸消旋酶基因dal 代替抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记得到可复制质粒pUB-P43-DPE-dal；并转化枯草芽孢杆菌1A751 (dal^-)中表达，获得一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于具体步骤为：

（1）在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal的上下游各选取800-900bp长度的片段作为同源臂，通过PCR将两段同源臂扩增，并胶回收；选取lox71-spc-lox66 抗性基因片段作为筛选标记，将上下游同源臂和lox71-spc-lox66片段通过融合PCR将三段基因连接在一起；将PCR产物转入枯草芽孢杆菌1A751感受态中，在含有壮观霉素spc的平板上筛选；由于同源臂的存在，发生同源重组，敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，得到D-丙氨酸缺陷型的宿主1A751(dal^-)-spc；

（2）将pTSC质粒导入上述宿主1A751(dal^-)-spc中，在含有红霉素的平板上筛选，在IPTG的诱导下，表达重组酶Cre，在重组酶Cre的作用下，lox71和lox66位点发生重组，将spc抗性基因删除，并获得一株D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal^-)；

（3）在DPE酶基因的上游通过PCR技术融合强启动子P43，并与DPE酶基因组成表达单元P43-DPE，然后构建至质粒pUB110中，得到质粒pUB-P43-DPE；

（4）敲除质粒pUB-P43-DPE上的抗生素抗性基因Kan和Blm，将D-丙氨酸消旋酶基因dal构建至表达载体pUB-P43-DPE中，得到质粒pUB- P43-DPE-dal；

（5）将重组质粒pUB- P43-DPE-dal转入宿主1A751(dal^-)感受态中，在LB平板上筛选，从而获得重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal。

4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于为增强表达，在DPE基因的上游添加P43启动子，P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中1-300位所示。

5.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于质粒pUB-P43-DPE-dal，其中含有所述SEQ ID NO.1中301-1170位所示的DPE酶基因和SEQ ID NO.2所示的D-丙氨酸消旋酶基因dal；所述D-丙氨酸消旋酶基因dal代替抗生素抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记。

6.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal的应用，其特征在于用于生产D-阿洛酮糖。