[发明专利]基于D‑丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法有效
申请号: | 201510294626.2 | 申请日: | 2015-06-02 |
公开(公告)号: | CN104894047B | 公开(公告)日: | 2018-03-30 |
发明(设计)人: | 江波;沐万孟;何伟伟;张涛 | 申请(专利权)人: | 江南大学 |
主分类号: | C12N1/21 | 分类号: | C12N1/21;C12N15/75;C12N15/61;C12P19/02;C12R1/125 |
代理公司: | 无锡市大为专利商标事务所(普通合伙)32104 | 代理人: | 时旭丹,张仕婷 |
地址: | 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 基于 丙氨酸 缺陷 筛选 标记 表达 阿洛酮糖 差向异构 重组 枯草 芽孢 杆菌 构建 方法 | ||
1.一种基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌,其组成为1A751-pUB-P43-DPE-dal,分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK38.001,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC NO:M 2015257。
2.权利要求1所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于包括敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal,得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751 (dal-);将来源于梭状芽胞杆菌(Clostridium scindens)ATCC 35704 的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶DPE基因和P43启动子构建至质粒pUB110中得到pUB-P43-DPE;用D-丙氨酸消旋酶基因dal 代替抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记得到可复制质粒pUB-P43-DPE-dal;并转化枯草芽孢杆菌1A751 (dal-)中表达,获得一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal。
3.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于具体步骤为:
(1)在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal的上下游各选取800-900bp长度的片段作为同源臂,通过PCR将两段同源臂扩增,并胶回收;选取lox71-spc-lox66 抗性基因片段作为筛选标记,将上下游同源臂和lox71-spc-lox66片段通过融合PCR将三段基因连接在一起;将PCR产物转入枯草芽孢杆菌1A751感受态中,在含有壮观霉素spc的平板上筛选;由于同源臂的存在,发生同源重组,敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal,得到D-丙氨酸缺陷型的宿主1A751(dal-)-spc;
(2)将pTSC质粒导入上述宿主1A751(dal-)-spc中,在含有红霉素的平板上筛选,在IPTG的诱导下,表达重组酶Cre,在重组酶Cre的作用下,lox71和lox66位点发生重组,将spc抗性基因删除,并获得一株D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal-);
(3)在DPE酶基因的上游通过PCR技术融合强启动子P43,并与DPE酶基因组成表达单元P43-DPE,然后构建至质粒pUB110中,得到质粒pUB-P43-DPE;
(4)敲除质粒pUB-P43-DPE上的抗生素抗性基因Kan和Blm,将D-丙氨酸消旋酶基因dal构建至表达载体pUB-P43-DPE中,得到质粒pUB- P43-DPE-dal;
(5)将重组质粒pUB- P43-DPE-dal转入宿主1A751(dal-)感受态中,在LB平板上筛选,从而获得重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal。
4.根据权利要求2或3所述的构建方法,其特征在于为增强表达,在DPE基因的上游添加P43启动子,P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中1-300位所示。
5.根据权利要求2或3所述的构建方法,其特征在于质粒pUB-P43-DPE-dal,其中含有所述SEQ ID NO.1中301-1170位所示的DPE酶基因和SEQ ID NO.2所示的D-丙氨酸消旋酶基因dal;所述D-丙氨酸消旋酶基因dal代替抗生素抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记。
6.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal的应用,其特征在于用于生产D-阿洛酮糖。
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