[发明专利]一种检测副溶血弧菌同源重组细胞自杀质粒丢失的引物对及方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测副溶血弧菌同源重组细胞自杀质粒丢失的引物对及方法。

背景技术

现代基因工程技术为了更好得研究基因的功能，发明了同源重组技术(Homologus Recombination)。同源重组是指发生在姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，它可以去除“敲除”、更变或引入“敲入”基因组上某个特定基因，进而来研究这个基因的功能。

细菌没有成对的染色体，一般通过携带有目的基因两翼同源臂的质粒，与基因组中的目的基因的两侧同源序列交换，从而达到敲除、更变或敲入这个基因的目的。基因交换成功后，下一步需要去除细菌内的质粒以防止同源序列继续交换。而用于同源重组的质粒通常携带有不耐受蔗糖的sacB基因或对温度敏感的ts复制元件，使含有该质粒的细菌在含有蔗糖的条件下无法生长，或使质粒在37℃以下的温度条件下无法复制，进而让不含有自杀质粒的细菌优势生长，质粒在细菌中的携带率下降直至消失，这种质粒被称为自杀质粒。

pDM4和pNQ705质粒已有公布的序列，但pYAK1的序列目前无法查到。因此在同源重组中检测pYAK1质粒的丢失，主要通过检测被敲除或更换的基因，若该基因无法检测到，则说明pYAK1已经丢失。pDM4和pNQ705虽然有全序列，但目前检测质粒丢失大多也采用类似检测pYAK1丢失的方法。这种方法的缺点在于每换一个被敲除或更换的基因，都要重新设计一对引物，耗时耗力。而在敲入基因的时候，有时质粒丢失的检测就显得比较困难。

发明内容

本发明提供了一个引物对，用于扩增含有R6K复制起点的目的片段，检测副溶血弧菌同源重组细胞中自杀质粒是否丢失。

引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的引物对是根据自杀质粒的π蛋白依赖型复制起点R6K设计的一对特异性引物。

本发明提供了一种包含所述引物对的PCR检测试剂盒，该试剂盒除了包括上述特异性引物对，还包括dNTP、Taq聚合酶、PCR buffer、阳性对照DNA、阴性对照DNA。

本发明还提供了所述引物对在检测副溶血弧菌同源重组细胞中自杀质粒是否丢失中的应用，所述自杀质粒含有π蛋白依赖性复制起点R6K。

优选的，所述自杀质粒为pYAK1、pDM4或pNQ705，pYAK1、pDM4或pNQ705是目前适用于副溶血弧菌同源重组的三种自杀质粒，三者均具有π蛋白依赖型复制起点R6K。

本发明也提供了一种检测自杀质粒的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的DNA；

(2)建立PCR反应体系，进行PCR扩增；

(3)扩增产物的检测与判断；

如扩增产物中出现385bp的条带，则说明待测样品中具有自杀质粒，否则，说明待测样品中不具有自杀质粒；

所述PCR扩增采用的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

所述的自杀质粒携带有π蛋白依赖性复制起点R6K。

优选的，所述自杀质粒为pYAK1、pDM4或pNQ705。

所述的待检样品为副溶血弧菌同源重组细胞。

所述的PCR反应体系包括：PCR buffer终浓度为1×，Taq DNA polymerase 2.5U，dNTP各250μM，上下游引物各10μM；所述的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述的PCR反应条件为：95℃5min；94℃35s，45-60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明引物对针对自杀质粒π蛋白依赖型复制起点R6K设计，特异性强，利用该引物对通过简单的PCR扩增即可检测副溶血弧菌同源重组细胞中自杀质粒是否丢失，操作简单，准确性高。

(2)本发明还可用于检测其它以R6K为复制起点的质粒的丢失。

附图说明

图1为实施例1结果判定示意图，M为DL5000DNA Ladder Marker；Lane1为pDM4阳性对照；Lane2为副溶血弧菌HZ；Lane3为副溶血弧菌HZ-Δtdh突变株。