[发明专利]修饰苯二酚类化合物的羟化酶基因

说明书

技术领域：

本发明涉及一种可参与聚酮类化合物合成后修饰苯二酚类化合物的羟化酶基因，以及该基因在组合生物合成中的应用。

背景技术：

苯二酚类聚酮化合物是由细菌、真菌或植物产生的一大类天然产物，有复杂多变的化学结构和生物活性，可开发为药物。其中二羟基苯甲酸内酯和二羟基苯乙酸内酯等苯二酚类化合物具有重要药用活性。

在苯二酚类聚酮化合物合成过程中，聚酮合酶将聚酮链环化并释放后所形成的化合物的核心骨架结构，可能需要修饰酶的修饰，才能使其具有生物活性或者使其某些性质逐步最优化。

发现可修饰合成苯二酚类聚酮化合物的酶，以得到更多有新颖结构的聚酮类化合物，是目前得到新型真菌苯二酚类聚酮类化合物的一种重要手段。

虽然现有技术中已有利用某些羟化酶催化进行芳烃类的羟化，比如，羟化酶在聚酮化合物的合成过程中对中间产物的芳烃结构进行羟基化的修饰。但有关苯二酚羟化酶基因的发现以及利用其修饰聚酮化合物，在聚酮类化合物中引入羟基化修饰的的研究还未见报道。发现新的与苯二酚类化合物合成后修饰相关的酶类具有重要的意义。

天然产物日规壳霉素(化合物1)为一种真菌苯二酚类聚酮化合物，对一些常见的致病菌有较为明显的抑制作用。

现有技术中没有从日规壳菌属类真菌中获得过苯二酚羟化酶基因。利用苯二酚羟化酶在日规壳霉素苯环上添加羟基可提高其生物活性。

发明内容:

本发明的目的是从日规壳菌属类真菌中获得的苯二酚羟化酶基因，获得有别于天然产物结构的新型苯二酚内酯类化合物。

本发明从发现的一株日规壳菌属类真菌(Gnomonia)的基因组分析中得到了日规壳霉素的合成基因。将日规壳霉素的合成基因在酵母菌中进行异源表达，从发酵产物中分离纯化得到了日规壳霉素。在分析日规壳霉素的合成基因的基因簇时，在比对过程中发现了其附近的一个预测基因为一个未知的羟化酶基因，命名为苯二酚羟化酶基因gnoSal，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明构建了可在酵母BJ5464中表达的含有生物合成日规壳霉素和羟基化苯二酚相关基因的重组质粒，并在酵母中进行异源表达，从发酵产物中提取到不同于原产物日规壳霉素结构的聚酮类化合物。

具体如下：

1、获得gnoSal基因

通过基因组挖掘和基因人工合成，获得合成日规壳霉素核心骨架(化合物1)的还原型聚酮合酶和非还原型聚酮合酶的编码基因gnoS1和gnoS2，以及苯二酚羟化酶基因gnoSal。

2、聚酮合酶酵母表达载体构建与酵母转化

将含有完整的gnoSal的DNA片段连接到PRS425载体上，构建了组成型表达质粒PRS425-gnomSAL。将实验室构建的含还原型聚酮合酶基因gnomS1的表达载体pBDL6061-gnomS1、含非还原型聚酮合酶基因gnomS2的表达载体pBDL6062-gnomS2和PRS425-gnomSal共同转入营养缺陷型酵母受体BJ5464进行异源表达中。

3、重组子的筛选

化合物1由还原型聚酮合酶GnomS1、非还原型聚酮合酶GnomS2协作生物合成。在表达载体pBDL6061-gnomS1和pBDL6062-gnomS2同时存在的基础上再将含苯二酚羟化酶基因gnoSal的表达载体PRS425-gnomSAL同时转入不能合成亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶缺失的酵母菌中，利用营养缺陷型标记筛选重组子。

4、代谢产物提取与HPLC液相分析

重组菌株培养发酵后用有机溶剂提取发酵产物并进行HPLC液相分析，分析产物结构。

发现除了天然产物化合物1(日规壳霉素cytosproneA)的峰外还得到了另外一个峰。分离产物进行进一步的结构分析证明得到了与天然产物化合物1不同结构的聚酮类化合物2，经质谱分析发现化合物2是在原产物化合物1的6位碳原子上加入了羟基。证明了苯二酚羟化酶基因可用于对日规壳霉素及其类似物的聚酮化合物的结构修饰，很适合对各种活性化合物进行分子结构修饰，增加聚酮化合物库的多样性。重组菌株发酵产物色谱图及产物结构见图3。图中化合物1是日规壳霉素天然产物。

序列表说明

SEQ ID NO.1gnoSal的核苷酸序列；

SEQ ID NO.2由SEQ ID NO.1推导出的gnoSal编码的氨基酸序列。

附图说明

图1为gnoSal基因片段的扩增结果；