[发明专利]用于筛选枯草芽孢杆菌荧光定量PCR内参基因引物

权利要求书

1.内参基因引物在制备枯草芽胞杆菌168菌株IPTG诱导表达猪圆环病毒衣壳蛋白过程荧光定量PCR检测试剂中的应用，所述的内参基因引物序列为clsA F: GGGTCCAGAACGCTGAGAA，clsA R: AAAGCCTCCGACATAACCG；和dnaN F: GCACTTGCCGCAGATTGA，dnaN R: AATGCAAGACGGTGGCTATC； 和rpoB F: TGTCCGCATTGATCGCAC，rpoB R: TCAAGCGTATTTCGCAGGTA；

所述的内参基因为clsA、dnaN和rpoB。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌荧光定量PCR内参基因筛选方法，步骤包括如下：

1）菌体总RNA的抽提、质量检测及cDNA合成；

2）SYBR Green 实时定量PCR扩增；

3）内参基因的筛选。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述步骤1）中的具体步骤为：

(1)挑取枯草芽孢杆菌单菌落转接瓶中，加氯霉素至终浓度为5μg/mL，培养至对数期，OD₆₀₀为0.6时，加1mM IPTG诱导， 6小时后进行RNA的提取；

(2) 取2mL菌液，12,000rpm离心收集细胞，加入液氮研磨三次，研磨充分呈白色粉末状；

(3) 加入2mL Trizol至研钵中，并将研钵中的液体全部转移至离心管中；

(4) 将裂解后样品或匀浆液室温放置 5-10 min，使得核蛋白与核酸完全分离；

(5) 加入0.4 mL 氯仿，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min；

12,000 rpm 4℃离心10 min；

(6) 吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min；

(7) 12,000 rpm 4°C 离心10 min，弃上清；

(8) 加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm 4°C 离心3 min，弃上清，室温干燥5-10 min；

(9) 加入30-50 µL RNase-free ddH₂O，充分溶解RNA；

(10)取适量RNA样品，加入10×Loading Buffer，100V电压下，进行1%的琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性；

(11)将RNA进行合理倍数的稀释，测其A260及A280数值，检测RNA的纯度；

(12) 利用全式金公司的逆转录试剂盒，将RNA分别逆转录为cDNA，每一个逆转录体系中加1μg RNA，42℃逆转录15min，85℃ 5s，去除逆转录酶活性。