[发明专利]一种人3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其临床应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用人自体表皮干细胞、黑色素细胞和基底层角质细胞为种子细胞，培养具有3D复层结构表皮细胞膜片的技术及其在临床中的应用。表皮干细胞是一类异质性细胞，具有不同的亚类，其分子特征、分化能力及细胞巢（resident sites）都不相同。表皮干细胞主要包括：毛囊干细胞（HFSCs）、毛囊外根鞘干细胞、表达keratin-15的毛囊多潜能干细胞(follicle pluripotent stem cells，fPSCs)、皮脂腺干细胞(SGSCs)、汗腺干细胞(sweat stem cell)和黑色素干细胞（melancyte stem cell,EPI-NCSCs）和滤泡表皮干细胞(IFESCs)等。

主要技术包括WBB细胞培养基的应用，Wbbase混合酶分离表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞，细胞的单层扩增培养，细胞的诱导分化，3D结构表皮细胞膜片培养技术以及临床治疗技术。

背景技术

皮肤由表皮、真皮和皮下组织组成，是人体最大最复杂的器官，具有保护、分泌、感知和代谢功能。皮肤缺损、色素脱失和烧伤等是临床上的常见疾病，其最主要的治疗方法是自体皮肤移植或采用临时皮肤替代物覆盖。此外，白癜风也是一种常见性皮肤色素脱失性疾病，发病机制目前还不清楚，治疗方法有激光照射等物理治疗法、药物治疗法和自体表皮移植法等方法。表皮移植法需要自体皮肤，然而，由于人体皮肤有限，人们一直在寻找一种永久性皮肤替代物，但永久性皮肤替代物仍依赖于有活性的自体多种皮肤种子细胞，主要包括各种表皮干细胞等。

表皮干细胞具有终身、无限的自我更新能力。它是一种具有产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞。从发生机制来看，干细胞并不直接分化产生终末分化细胞，而是先分化成短暂扩充细胞，短暂扩充细胞有产生定向分化成某种终末分化细胞的能力，因而是定向祖细胞。短暂扩充细胞再经过几次到十几次不等的分裂后定向分化，进一步可分化为有丝分裂后细胞及终末分化细胞。短暂扩充细胞的存在说明组织靠较少量的干细胞分裂为很多的子代分化细胞。干细胞自我更新和分化的方式通常有两种，一种是不对称方式分裂，即1个干细胞分裂成1个干细胞和一个定向祖细胞，常见于单细胞生物和无脊椎动物；另一种是具有高度调控机制的分裂方式，干细胞按一定的概率分裂成干细胞或定向祖细胞，即干细胞按一定的概率分裂为两个干细胞或两个定向祖细胞，或按不对称方式分裂。 一般认为哺乳类动物即以此种方式进行自我组织更新。细胞的更新具有准确无误性，干细胞在整个增殖过程中处于相对静止状态，而由短暂扩充细胞完成DNA合成和细胞扩充的任务，干细胞在分裂后仍保留其原有的遗传信息，短暂扩充细胞拥有新复制DNA序列，以保证差错仅停留在短暂扩充细胞水平。通常干细胞等数分裂干细胞和定向祖细胞，当受到损伤等情况时，干细胞的分裂方式会发生改变以适应机体的需要。

皮肤上皮层是一层保护机体免受外界环境损伤的重要屏障。该层主要为角质细胞类型，包含了大约85%的活表皮细胞。角质层是复扁平上皮细胞。在表皮基底层,角质细胞分化、增殖，随着角质细胞产生角蛋白并上移至表皮表面后，发生程序性死亡。角蛋白细胞增殖、分化及凋亡是复杂且严格控制的过程。角蛋白细胞可产生很多细胞因子和生长因子，包括IL-1, IL-3, IL-6, IL-8, 集落刺激因子, TNF-alpha, TGF-alpha and beta, 成纤维细胞生长因子,双调蛋白和PDGF。除了保护功能之外，角蛋白细胞在组织稳态、伤口恢复、癌症以及皮肤基因治疗上有着重要的作用。人角蛋白细胞能表达粘附分子和细胞因子，能参与皮肤免疫和动态平衡。

黑色素细胞起源于外胚层的神经嵴，位于表皮的基底层，与表皮细胞共同组成表皮黑色素单位，其主要功能是产生黑色素小体保护皮肤免受损害。1960年Cruickshank首次报道体外培养黑色素细胞以来，由于培养技术未突破，一直未得到大量纯化的黑色素细胞。1982年，美国Eisinger和Marco用一种含有致癌因子TPA的培养基培养出大量人黑色素细胞，但仅能存活几个月。

近年来,对表皮细胞、表皮干细胞和黑色素细胞等单独培养方法的报导很多, 但目前还未见到将三种细胞共培养形成具有三维复层结构表皮的报道。因此，建立一种表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞形成三维复层结构表皮的制备方法与移植新技术具有重要的经济和社会意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种人表皮干细胞、黑色素细胞和基底层角质细胞形成3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其在皮肤缺失、烧伤和皮肤色素脱失性疾病中的应用。