[发明专利]多层级固定化乳糖酶的制备方法、该方法制得的多层级固定化乳糖酶及其应用

权利要求书

1.一种多层级固定化乳糖酶的制备方法，包括以下步骤：

1)多层级介孔硅材料的合成，包括以下步骤：

A.在20～40℃条件下，将0.5～4g三嵌段共聚物溶解于150ml、0.5～2M的盐酸中，然后加入0.5～3g均三甲苯，并于室温搅拌1～8h；

B.将步骤A所得溶液升温至40℃，加入5～20g硅前驱体，连续搅拌12～48h后，于100℃密封静置老化12～48h；

C.将固相和液相分离，然后将分离后的固相于400-600℃碳化1～6h，得到多层级介孔硅材料；

2)固定化乳糖酶的制备：取100mg制得的多层级介孔硅材料，与2ml、浓度80-150mg/ml的乳糖酶液混合，在150-300r/min的转速下，振荡吸附0.5-3h，然后离心分离，得到多层级固定化乳糖酶粗品；

3)洗涤：用浓度为0.01-0.5M、pH值为7.0-10.0的磷酸缓冲液多次冲洗多层级固定化乳糖酶粗品，得到多层级固定化乳糖酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在所述步骤2)的振荡吸附完成后，还对多层级固定化乳糖酶粗品进行再处理，具体为：将多层级固定化乳糖酶粗品浸没于体积百分比浓度为0.1-2.0％的戊二醛中，在150-300r/min的转速下，连续振荡0.5-3h，再用浓度为0.01-0.5M、pH值为7.0-10.0的磷酸缓冲液洗涤沉淀，然后将洗涤后的沉淀置于浓度为0.01-0.5M、pH值为7.0-10.0的Tris-HCL浸泡液中振荡反应0.25-1h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤1)中，所述三嵌段共聚物为P123或F127。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述硅前驱体为正硅酸甲酯或1，2-二(三乙氧基硅基)乙烷。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，用浓度为0.01-0.5M、pH值为7.0-10.0的磷酸缓冲液进行洗涤的次数为3-5次，每次洗涤5min，优选的是，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1M、pH值为7.0。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：将洗涤后的沉淀置于Tris-HCl浸泡液中进行振荡反应时的转速为150-300r/min。

7.一种由权利要求1-6中任一项的制备方法制得的多层级固定化乳糖酶，其特征在于：由载体和乳糖酶分子构成，所述载体为由硅前驱体脱水缩合而成的多层结构，在层与层之间形成有空隙，且每层结构上形成有多个直径为2-50nm的通孔；所述乳糖酶分子存在于所述层与层之间的空隙内，并借助戊二醛彼此连接在一起。

8.根据权利要求7所述的多层级固定化乳糖酶，其特征在于：所述的硅前驱体为正硅酸甲酯或1，2-二(三乙氧基硅基)乙烷。

9.一种权利要求1-6中任一项的制备方法制得的多层级固定化乳糖酶用于合成低聚半乳糖的方法，其特征在于：在20～60℃下，将乳糖溶解于浓度为0.01-0.5M、pH值为4.0～10.0的磷酸缓冲液中，使乳糖的浓度为30-60wt％，然后加入多层级固定化酶，振荡反应2-7h，制得低聚半乳糖，其中所述多层级固定化酶的加入量为6-25g/25ml溶液。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述反应的温度为45℃，磷酸缓冲液的浓度为0.1M、pH值为6.0，所述乳糖在磷酸缓冲液中的浓度为50wt％，所述多层级固定化酶的用量为20.0g/25ml溶液，振荡反应时间为4h；优选的是，在反应体系中还加入2mmol/L的Mg²⁺。