[发明专利]一种高均一性单价链霉亲和素四聚体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高均一性、无重组标签的单价链霉亲和素四聚体的制备方法。

背景技术

链霉亲和素(Streptavidin，SA)是由阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)培养过程中分泌的一种小分子非糖基化蛋白质，全长编码区183个氨基酸(aa)，包含24aa的信号肽，成熟分子159aa。菌体外的天然活性形式为从13至139aa的成熟肽，成熟分子的分子量为15kD，其天然形式为同源四聚体，分子量60kD，SA的成熟活性结构为127个氨基酸的多肽，称为SA核心序列，具有抗蛋白酶的特性。1963年，Dr.Stapley首先发现并报道了SA。本世纪以来，SA由于其与生物素(Biotin，又称维生素H、辅酶R)有极高的亲和力和特异性而受到国际生物学和医学界的高度重视。SA对其配体生物素的亲和力(10^-16M/L)比已知的抗原-抗体的亲和力(10^-7～10^-12M/L)高4～6个数量级。高亲和力和高特异性并不是SA的唯一特性，SA与Biotin的结合速度极快，即便是在极低浓度和4℃环境下也是如此。另外，由于生物素是小分子(31Da)，因而蛋白生物素化几乎不影响生物功能。SA-Biotin复合物可以耐受变性剂(如6M盐酸胍)、去垢剂(如SDS)、90℃高温和pH 3～11的环境。与其他靶向标签(如Halo-Tag和SNAP-Tag)相比，SA有更多便利，不论是体外或体内，其可借助大肠杆菌的生物素连接酶(E.coli biotin ligase)将其配体标记到目标蛋白。SA的这些特性，引发了科学家对SA和其配体Biotin进行各种生物改造的兴趣。

野生型SA(wtSA)分子与Biotin的结合速度(on-rate)虽然很快，但结合力不够稳定持久(high off-rate)，这使得在连续长时间观察的动态实验(如细胞生物学领域)与影像研究中应用SA受到阻碍。另一方面，wtSA与生物素的异乎寻常的亲和力(10^-16M/L)，又使得在分离制备时，需要进行变性条件下的洗脱。而且，尽管wtSA对生物素的亲和力极高，但其对某些极具用途的生物素衍生物(如2-亚氨基生物素)则结合力不够理想(兼容性不理想)。再有，链霉亲和素作为一种同源四聚体蛋白，含有四个生物素的高亲和力位点，可能同时结合多个生物素化配体而导致结合配体的聚合。依据上述原因，我们提出了对SA进行分子改造的必要性。

目前，用亲和层析法获得的单价链霉亲和素四聚体，优点是具有一个Biotin结合位点，缺点是均一性有待于提高，另外制备过程中使用的外源纯化标签能够降低SA对Biotin的亲和力。本发明用蛋白酶PK(蛋白酶K)和SU(枯草杆菌蛋白酶)等蛋白酶处理单价链霉亲和素四聚体的优点是可以筛选出更稳定的蛋白，同时可以去除有外源纯化标签(histag)的影响以避免其对配体结合的不利影响，并降低致免疫反应性，本发明内容目前还未见有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高均一性、无重组标签的、稳定的单价链霉亲和素四聚体的制备方法，利用C端带有His₈-tag标签的重组蛋白和活性缺失突变体构建重组质粒，感受态细胞转化质粒得到。

本发明的制备方法具体通过以下技术方案实现：

一种高均一性无重组标签的单价链霉亲和素四聚体的制备方法，包括以下步骤：

1)将链霉亲和素野生型和活性缺失突变体分别克隆到pET28a载体中的NdeI和XhoI酶切位点得到两个重组质粒；

2)重组质粒转化到E.coli感受态细胞BL21(DE3)中，细胞培养到OD₆₀₀＝0.7时加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM进行诱导，37℃诱导5小时后收集细胞，-20℃冻存；

3)冻存细胞按缓冲液：菌体重量5ml/g的比例使用破菌缓冲液重悬后在冰浴中进行超声波破碎，离心后取沉淀使用洗涤缓冲液重悬，在16℃搅拌洗涤30min，离心弃掉上清，重复洗涤至包涵体的纯度达到90％以上；