[发明专利]一种同时测定人环孢素作用靶点基因多态性的方法

说明书

本发明提供的一种同时测定人环孢素作用靶点基因多态性的方法，即一种同时测定环孢素作用靶点通路系列蛋白编码基因多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点基因型的方法，操作简便、无需序列特异性探针，一张芯片可对384个样本进行多重检测，每个体系最多可实现40重反应，同时检测40个SNP位点，通量可根据要求进行个性化调整，高通量，适用范围广，几十到成千上万个样本，同时检测几十到成百上千个位点；无需荧光标记，仅需合成普通引物，单个分析成本低；高灵活度，一张芯片上样本和位点检测匹配可随意选择；分析所需样本量少(10ng)，高灵敏度，检测精度高。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种同时测定环孢素(Cyclosporine，CsA)作用靶点通路系列蛋白编码基因多个单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)位点基因型的方法，即一种同时测定人环孢素作用靶点基因多态性的方法。

背景技术

环孢素治疗窗窄，疗效存在显著个体差异，目前，临床上通常通过对其进行治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，TDM)，即监测血药浓度，以调整环孢素的剂量。但传统的TDM难以从药效学的角度反映个体之间的变异，而且TDM只有在服药后方可实施，无法在服药前预测机体对药物的反应，药物的初始剂量难以确定。因此，单纯依靠TDM来进行环孢素的个体化治疗显然是不够的，迫切需要寻找新的个体化治疗策略。

现有技术公开了遗传变异是导致药物效应个体间变异的最主要因素之一。通过研究遗传变异与药物反应的关系，可以根据基因型制定药物的初始剂量，也可以筛选药物反应敏感或无效的特定人群，进行个体化治疗，药物基因组学是个体化药物治疗发展的新台阶。到2014年8月，FDA已经批准或修订138种药物说明书，建议检测基因型，以提高药物使用的有效性和安全性。

药物基因组学研究涉及药动学和药效学相关基因的遗传多态性。目前环孢素在体内的作用靶点和通路已经明确。环孢素进入T细胞后与一种免疫亲和素—亲环蛋白(Cyclophilin，CyP)相结合，CyP-CsA复合物会专一性地结合以及抑制胞浆内钙调磷酸酶(calcineurin，CaN)，活性，阻断活化T细胞核转录因子(nuclear factor of activated Tcell，NFAT)的去磷酸化，进而抑制IL-2的基因转录，从而抑制T细胞的后续活化。在环孢素作用信号通路的重要分子(CyP、CaN及NFAT)的功能状态，对于环孢素药理作用的发挥，起到至关重要的作用。环孢素作用靶点信号通路中的CyP、CaN及NFAT的编码基因单核苷酸多态性，影响基因功能，进而影响环孢素与CyP、CyP与CaN、CaN与NFAT、以及NFAT与靶基因的相互结合，从而最终影响环孢素的免疫抑制作用。

CyP属于免疫亲和素的一个亚类，现已发现其编码基因为PPIA。CaN以异二聚体的形式存在，由61ku的催化亚基Calcineurin A(CNA)和19ku的调节亚基Calcineurin B(CNB)组成。CNA有三个亚型，CNAα、CNAβ和CNAγ，其编码基因分别为PPP3CA、PPP3CB和PPP3CC。CNB有两个亚型，分别是CNB1和CNB2，其编码基因分别是PPP3R1和PPP3R2。其中CNAα、CNAβ及CNB1在体内广泛表达，而CNAγ和CNB 2则只存在于大脑和睾丸中。NFAT是属于Rel蛋白家族，Rel蛋白家族包括NF-kB及NFAT，是保守的DNA结合域。NFAT有5种亚型，分别是NFATC1、NFATC2、NFATC3、NFATC4、NFAT5。其中NFATC1、NFATC2、NFATC3主要存在于T淋巴细胞等免疫细胞中，NFATC4存在于包括心脏在内的其他组织细胞中。NFAT5，不同于其他4种蛋白，不受细胞内钙离子浓度的调节，主要通过激活高渗诱导的肿瘤坏死因子(TNF)基因转录，参与T细胞生长、发育的调节。CaN-NFAT信号通路在免疫系统与非免疫系统中，都发挥了重要的作用。CyP、CaN及NFAT的编码基因都有单核苷酸多态性。综上所述，检测环孢素靶点通路基因的遗传变异对预测环孢素药物反应有较重要的临床意义。