[发明专利]一种检测水体鸭粪污染的巢式PCR试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种检测水体鸭粪污染的巢式PCR试剂盒，包括两对巢式PCR引物、dNTP、PCRbuffer、Taq酶、Mg²⁺溶液和ddH₂O，其特征在于：所述的两对巢式PCR引物为：

SDF:5’‐GCATAGGGCAACACGGAAAG‐3’；

SDR:5’‐GTTCTGGGTGTTGTCCGGTA‐3’；

NDF:5’‐CCACGTAAATGCCAAAGATG‐3’；

NDR:5’‐CTGAGCTAGAGGAAGGCT‐3’。

2.根据权利要求1所述的检测水体鸭粪污染的巢式PCR试剂盒，其特征在于，所述PCRbuffer为10×PCR buffer，所述dNTP浓度为2.5mmol/L，所述Taq酶浓度为5U/ul，所述Mg²⁺溶液浓度为25mmol/L。

3.采用权利要求1或2中所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸭粪污染的方法，其步骤为：

(1)提取待测水样DNA；

(2)以水样DNA为模板，进行第一轮PCR扩增，PCR引物为SDF和SDR；

(3)第一轮PCR扩增结束后，取PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，PCR引物为NDF和NDR；

(4)凝胶电泳，观察第二轮PCR产物中是否存在长度为158bp的条带，若存在，则表明水体受到了鸭粪污染。

4.根据权利要求3所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸭粪污染的方法，其特征在于，步骤(2)中第一轮PCR引物为SDF和SDR，反应体系为2.5ul的10×PCR buffer；2.5ul dNTP；0.1ulTaq酶；2ul Mg²⁺；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物SDF 、SDR ；2ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至25ul；反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，57℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存。

5.根据权利要求3所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸭粪污染的方法，其特征在于，步骤(3)中第二轮PCR引物为NDF和NDR，反应体系为2.5ul的10×PCR buffer；2.5ul dNTP；0.1ulTaq酶；2ul Mg²⁺；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物NDF 、NDR ；0.5ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至25ul；反应条件为95℃，预变性3min；95℃15s，60℃15s，72℃30s，40个循环；72℃7min，4℃保存。

6.根据权利要求3所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸭粪污染的方法，其特征在于，步骤(4)中凝胶电泳为1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min。

7.根据权利要求3所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸭粪污染的方法，其特征在于：步骤(4)中检测阈值为0.0012ng/ul鸭粪DNA。

8.根据权利要求3所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸭粪污染的方法，其特征在于：步骤(2)后对第一轮PCR产物进行凝胶电泳，若存在长度为722bp的条带，则表明水体受到了较严重的鸭粪污染，检测阈值为0.019ng/ul鸭粪DNA，无需进行步骤(3)和步骤(4)。