[发明专利]一种巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）透明质酸的半胱氨改性：

将透明质酸钠溶解于去离子水中，首先加入N-琥珀酰亚胺（NHS），充分溶解；然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC•HCl)粉体 ，用1M的NaOH和1M的HCl溶液调整反应液的pH=4.75，反应2个小时；随后加入半胱氨盐酸盐（CSH•HCl）溶液，反应24个小时；最后用1M的NaOH溶液调整反应液的pH=8.5，加入二硫苏糖醇（DTT）溶液，反应12个小时，控制所得巯基-透明质酸化合物中的半胱氨接枝率为10%～60%，所述二硫苏糖醇（DTT）的加入既能够避免冷冻干燥后得到部分海绵状产物无法在后续步骤中溶解的现象又能够有效控制透明质酸表面的表面巯基密度保证最终获得的水凝胶具有可控自交联特性；反应结束后，用1M的HCl溶液调整反应液的pH=3.0-3.5，在pH=3.0-3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到一种具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物，即半胱氨改性透明质酸；

2）将步骤1）中的制备的半胱氨改性透明质酸溶解于pH=7.4的PBS缓冲液中，然后调节pH值至7.4～8.0，通过巯基之间形成二硫键的反应，形成三维化学交联的水凝胶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，透明质酸钠中羧基：N-琥珀酰亚胺：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐：半胱氨盐酸盐：二硫苏糖醇的物质的量之比为1：2：2~4:1~4:3~12。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中半胱氨改性透明质酸溶液的质量百分比浓度为1.0%-3.0%。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤2）中将溶解后的半胱氨改性透明质酸置于相应的模具中进行凝胶反应以获得特定形状的水凝胶；或者将溶解后的半胱氨改性透明质酸制成注射液，注射后使其在目标区域原位成胶。

5.一种采用权利要求1所述方法制备的巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的凝胶时间可精确调控，且能够避免制备过程中部分半胱氨改性透明质酸发生二硫键交联导致冷冻干燥后得到部分海绵状产物无法在后续步骤中溶解的现象。

6.一种权利要求5所述的水凝胶的应用，其特征在于，将其用作三维细胞培养支架或将其制成可注射水凝胶。

7.一种三维细胞培养支架体系，其特征在于，包括权利要求5所述的巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶以及均匀分布于其中的细胞。

8.一种权利要求7所述的三维细胞培养体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将步骤1）中制备的具有自由巯基的巯基-透明质酸化合物溶解于培养基中，然后加入细胞悬液，混合均匀，形成混合液；

（2）通过巯基之间氧化形成二硫键的反应，使所得混合液中的透明质酸形成三维化学交联的水凝胶并将细胞包裹于其中。

9.根据权利要求8所述的三维细胞培养体系的构建方法，其特征在于，步骤（2）具体为：将步骤（1）制得的混合液加入到模具中，随后在37℃、0.5%CO₂ 细胞培养箱中进行成胶过程，最后将包裹细胞的水凝胶从模具中取下，加入培养基中，在37℃、0.5%CO₂ 细胞培养箱中进行培养；或者，直接将步骤（1）制得的混合液注射到生物体体内，使透明质酸在生物体体内发生三维化学交联形成水凝胶。