[发明专利]一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及水体污染检测领域，更具体地说，涉及一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试剂盒及其检测方法。

背景技术

近年来，随着人口和经济的增长，水体污染情况日趋严重，其中粪便污染尤为突出。粪便污染物进入水体后不仅会增加水体氮磷含量，造成水体富营养化，并且会带入粪便中可能存在的致病菌，引发疾病的水体传播(Baldursson S and Karanis P.Waterborne transmission of protozoan parasites:Review of worldwide outbreaks‐An update 2004‐2010.Water Research 2011；45(20):6603‐6614.)。因此进行水体粪便污染防治已刻不容缓。

粪便污染的潜在污染源种类繁多，畜禽养殖业中的猪、鸡等常见物种的粪便排泄物，由于缺乏适当的处理，常常被直接排放到环境中，造成水体粪便污染，另外，随着宠物(尤其是宠物狗)的数量越来越多，其产生的粪便排泄物也成为了水体粪便污染的来源之一。在点源、面源污染同时存在的情况下，缺乏对粪便污染来源的准确掌握和定位，使得治理工作职能停留在“见污治污”阶段，在一定程度上增加了污染治理的成本。如何寻找和区分并快速、准确定位水体中的粪便污染源，成为了解决问题的关键。

传统粪便污染检测方法通过检测水中粪便污染指示菌(如大肠杆菌、肠球菌等)来判断水体粪便污染情况，耗时长且无法区分污染源。通过检测水体宿主特异性微生物或化学标志物，可以达到粪便污染溯源的目的，但现存的一些微生物及化学标志物特异性不高，往往导致假阳性结果的产生。粪便中存在大量来自脱落肠道细胞的线粒体DNA，由于不同物种的线粒体DNA不同，其中特定片段中存在大量单核苷酸多态位点，使得线粒体DNA具有种属特异性，可以通过检测受粪便污染水体中的线粒体DNA片段来达到粪便污染溯源的目的(Caldwell J,Payment P and Villemur R(2011)Mitochondrial DNA as Source Tracking Markers of Fecal Contamination.)。

以PCR为基础的分子生物学技术的快速发展为水体粪便污染的检测提供了强有力的工具。但目前常用的基于PCR手段的粪便污染溯源方法通常只能对污染源进行单独检测(Caldwell JM and Levine JF.Domestic wastewater influent profiling using mitochondrial real‐time PCR for source tracking animal contamination.Journal of microbiological methods 2009；77(1):17‐22.Schill WB and Mathes MV.Real‐time PCR detection and quantification of mine potential sources of fecal contamination by analysis of mitochondrial cytochrome b targets.Environmental science&technology 2008；42(14):5229‐5234.)。目前尚未公开能够区分多种污染源的检测方法。本发明通过比对不同物种的线粒体DNA序列，找到了狗、猪、鸡特异性DNA片段，并针对不同片段设计了特异性引物，且不同引物的扩增片段长度具有一定差距，使得在一个PCR反应体系中区猪、狗、鸡三种粪便污染源成为可能。

发明内容

1、要解决的问题

目前检测水体粪便污染的PCR方法通常是对潜在污染源进行逐个排查，耗时久且成本高。针对此问题，本发明提供了一种能够同时检测水体中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试剂盒及其检测方法，可以达到快速、准确排查或检测水体粪便污染源的目的。

2、技术方案

本发明的目的通过以下技术方案实现

一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR方法及试剂盒，包括引物、Taq酶、dNTP、PCR buffer、Mg²⁺溶液和ddH₂0，其中引物包括：

引物1：5’‐CTGTGCTATGTCAGTATCTCCAG‐3’；

引物2：5’‐GGCTGATTAGTCATTAGTCCATCG‐3’；