[发明专利]寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种选择性扩增目标核酸序列变异体的方法。通过采用一种特殊结构的寡聚核苷酸片段，该片段分为引物区和变异体识别区。当非待检测核酸变异体作为模板时，变异体识别区与引物区延伸产生的序列，形成一种发夹结构；当待检测变异体作为模板时，变异体识别区与引物区延伸产生的序列无法形成稳定的发夹结构。上述发夹结构不适宜作为下一轮扩增的模板，抑制了扩增效率，待检测变异体由于无法形成稳定的发夹结构，因此可以得到有效扩增从而实现选择性扩增。

本申请要求申请日为2015年4月15日、申请号为201510177952.5、发明名称为“寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及选择性扩增目标核酸序列变异体的方法，具体是涉及一种寡聚核苷酸片段、及使用其进行选择性扩增目标核酸序列变异体的方法。本发明还涉及检测核酸变异体的试剂盒的应用，广泛应用于核酸扩增、基因分型等领域。

背景技术

等位基因一般指位于一对同源染色体的相同位置上控制着相对性状的一对基因，具有多态性。等位基因多态性分析应用的领域广泛，包括法医鉴定、药性分析、基因分型、器官移植，也包括检测大量野生型基因背景的肿瘤细胞中的基因突变等。但是通常情况下，肿瘤细胞相较于周围正常的组织细胞所占的比例相当低，检测到肿瘤细胞十分困难，尤其检测大量野生型基因背景中肿瘤基因的单点突变尤为困难。为了检测少量的目的核酸序列的突变变异体，目前一般将选择性扩增的方法与选择性检测的方法结合进行检测。选择性检测方法有高分辨率熔解曲线、探针杂交、TaqMan^TM探针等方法。美国专利公开的(U.S.Pat.Nos.5,210,015,5,538,848 and 6,326,145)TaqMan^TM探针方法是探针特异性的与待检测核酸片段杂交，并且在具有5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的作用下酶切，所产生信号用来指示存在待检测目的片段。但由于突变型变异体所占比例十分稀少，易导致信号淹没在与待检测目的序列突变型变异体相似的野生型变异体所产生的信号中，而选择性扩增法的选择性较高。

因此，等位基因选择性扩增允许我们选择性的扩增并检测目的核酸序列的突变型变异体。在一个成功的选择性扩增系统中，只有目的核酸序列中的突变型变异体被扩增，而目的核酸序列的野生型变异体不被扩增、或者目的核酸序列的野生型变异体的扩增效率远远低于目的核酸序列中突变型变异体的扩增效率。为了达到选择性扩增的目的，多种方法被开发出来，如下述的PCR夹子方法、RFLP-PCR方法、数字PCR方法、低变性温度下共扩增PCR方法。

PCR夹子方法(PCR clamping method)通过抑制目的核酸序列的野生型变异体的扩增来达到选择性扩增待检测目的片段的目的。使用肽核酸(PNA)或使用锁核酸(LNA)的方法分别在文献[Henrik et al.,Nucleic Acid Research 21:5332-5336(1993)]和[Luo etal.,Nucleic Acid Research Vol.34,No 2 e12(2006)]中公开。但是，与目的核酸序列的野生型变异体与突变型变异体通常只有一个碱基与待检测目的片段不同，这种方法并不能完美的抑制住这些非目的片段的扩增。

RFLP-PCR方法通过在PCR反应之前或是在PCR反应的过程中使用限制性内切酶，除去了与目的核酸序列突变型变异体相似的野生型变异体，从而达到扩增并富集目的核酸片段的突变型变异体的目的。基于此方法有多种变化，包括限制性酶切位点突变分析PCR(RSM-PCR)方法，通过在突变位点基于引物连接的扩增(APRIL-ATM)方法等等。虽然这类方法具有设计简单和成本低廉的优点，并且在一些特定的实验中具有较好的选择性，但是它依赖于突变位点附近具有限制性内切酶酶切位点，在具体应用中，这类方法的选择性有限。