[发明专利]一种重组人粒细胞刺激因子多肽的纯化方法

权利要求书

1.一种重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）选用pPIC9K-G-CSF15-75-GS115工程菌做菌株进行发酵培养；

2）发酵培养液12000rpm，离心10min，上清液过0.45μm滤膜；

3）对过滤上清进行疏水层析纯化处理，得到疏水层析产物；

4）对疏水层析产物阴离子交换，得到阴离子交换液；

5）对阴离子交换液进行凝胶过滤，得到重组人粒细胞集落刺激因子多肽；

其中，步骤3）疏水层析柱填料为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow high sub，疏水层析平衡缓冲液为10 mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0，加固体NaCl 调节电导率 50ms/cm；洗脱缓冲液为10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5；

步骤4）阴离子交换层析柱其柱填料为聚苯乙烯-二乙烯苯SKI-10，阴离子层析平衡缓冲液为10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5；洗脱缓冲液为100 mmol/L HAc-NaAc，pH5.0；

步骤5）凝胶过滤柱填料为Sephacryl s-100HR，凝胶层析洗脱缓冲液为10 mmol/LHAc-NaAc，pH 5.0。

2.如权利要求1所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，所述的工程菌为保藏号为CGMCC NO:10713的巴斯德毕赤酵母菌。

3.如权利要求1所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于步骤3）具体实施步骤为：

样品预处理：接收步骤2）所得过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体NaCl 调节电导率至50ms/cm；

平衡：设置检测波长280nm，用5-10倍柱体积平衡缓冲液平衡，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；

上样：上样时泵流速为8.0-18.5 ml/min，上样结束后用5个柱床体积平衡缓冲液复平衡；

洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱，调节泵流速为5.5-10.2ml/min，根据UV值的变化收集主峰。

4.如权利要求1所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，所述的步骤4）具体实施步骤为：

样品预处理：接收步骤3）所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8.5，加水稀释至电导率为1-4ms/cm；

平衡：设置检测波长280nm，用5-10倍柱体积平衡缓冲液平衡，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；

上样：将疏水层析峰直接上样，上样时泵流速为8.5-19.8 ml/min ，上样结束后用5个柱床体积平衡缓冲液复平衡；

洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱，调节泵流速为5.5-10.2ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。

5.如权利要求1所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，所述的步骤5）具体操作步骤为：

平衡：设置检测波长280nm，用5-10个柱体积HAc-NaAc缓冲液平衡，平衡时泵流速为0.3-1.17 ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；

上样：将阴离子交换纯化后目的蛋白直接上样, 上样时泵流速为0.3-1.17ml/min，样品上样量为柱体积的0.5%-4%；

洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc缓冲液洗脱，调节泵流速为0.3-1.17 ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。