[发明专利]一种基于四面体嵌银结构的检测血管内皮生长因子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种基于四面体嵌银结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，属于分析化学领域。

背景技术

血管内皮生长因子（VEGF）是作用于血管内皮细胞的一类糖蛋白，以同源二聚体的形式存在，具有强烈的促内皮细胞增殖作用，促进新血管的形成。而肿瘤组织的生长，必须依靠新生血管生成来提供足够的氧气和营养物质来维持，因此，VEGF已被认为是肿瘤标志物。对肿瘤标志物的检测有助于早期发现癌症，实现早期治疗的目的。

传统的VEGF检测方法主要为酶联免疫法等，对单克隆抗体的要求较高，而且单克隆抗体的筛选是一项繁重且高耗的任务。本发明提出了一种新型的、简便的、灵敏的检测方法，其基于纳米材料自组装技术构建了具有表面增强拉曼散射效应的纳米结构，并以此作为检测基底，通过单链DNA之间的互补杂交，将包裹有信标分子的银纳米粒子嵌入金纳米粒子四面体结构上，利用粒子之间的电场增强效应，获得强的拉曼散射信号。银纳米粒子上适配体因与目标物VEGF亲和力强从而从四面体骨架上解离下来，造成拉曼信号下降，据此得拉曼信号强度与目标物VEGF浓度的标准曲线，实现VEGF浓度的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于四面体嵌银结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法。

本发明的技术方案，一种基于嵌银四面体结构的超灵敏检测血管内皮生长因子（VEGF）的方法，是基于四面体嵌银结构拉曼信号强度改变对目标VEGF浓度进行检测的方法，包括金纳米粒子的合成、金纳米粒子修饰单链DNA、嵌银四面体的组装以及 VEGF传感器的构建，具体如下：

一、嵌银四面体结构的构建：

（1）10 nm 粒径的金纳米粒子的合成：

10nm粒径的金纳米粒子采用鞣酸还原法合成，反应用的锥形瓶提前用新配置的王水浸泡24h，用超纯水冲洗至洁净，烘干待用。锥形瓶中加入79mL超纯水和 1mL质量浓度1%氯金酸作为A液；另取一洁净的小瓶子，加入4mL质量浓度1%柠檬酸三钠，0.1mL质量浓度1%鞣酸，0.1mL 25mM碳酸钾，15.8 mL超纯水作为B液；A、B液均加热到 60℃，然后在高速搅拌下把 B 液迅速加入A液中，混合液在 60℃下继续搅拌30min到形成深红色溶液。然后将溶液加热回流 2 min形成亮红色溶液。最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示平均粒径为10nm。

（2）6 nm粒径的银纳米粒子的合成：

在聚乙烯吡咯烷酮的保护下采用硼氢化钠还原硝酸银的方法合成粒径为6 nm的银纳米粒子；锥形瓶的处理同上。锥形瓶中加入超纯水20mL、1% PVP 5mL、0.1M硼氢化钠（新配）0.6mL，冰浴搅拌状态下以30mL/h的速度泵入5mL 1% 的聚乙烯吡咯烷酮PVP，5mL 1M的硝酸银溶液。反应后的溶液80℃水浴3h，以排除多余的硼氢化钠，冷却后放4℃冰箱待用。

（3）金纳米粒子修饰DNA：

所得金纳米粒子溶液中加入二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，使其终浓度为0.01mg/mL，室温震荡反应包裹12h后，13000rpm 离心浓缩十倍，以10 mM pH 7.4的Tris-HCl 缓冲液重悬，溶液四等分，编号依次为Au1，Au2， Au 3，Au 4。

分别对应加入5’端巯基修饰的单链DNA序列1,2,3,4（DNA1，DNA2，DNA3， DNA4），使其终浓度均为5nM。室温孵育2h后每隔1h加入NaCl溶液，至金纳米粒子溶液中盐粒子浓度为300 mM为止。溶液室温老化24h后离心除去未结合的单链DNA，10 mM Tris-HCl重悬待用。

DNA1:

5’-SH-TTTGCCTGGA GATACATGCA CATTACGGCT TTCCCTATTA GAAGGTCTCA GGTGCGCGTT TCGGTAAGTA GACG-3’；

DNA2:

5’-SH-TTTCGCGCAC CTGAGACCTT CTAATAGGGT TTCAGTCCAC

CCCCACAAAC TAGAATGCCC TTTGGGCTGT TCCGGG-3’；

DNA 3:

5’-SH-TTTGGCCGAG GACTCCTGCT CCGCTGCGGT TTCAGTCCAC

CCCCACACGT CTACTTACCG TTTCAGTCCA CCCCCACACC CGGAACAGCC C-3’；

DNA 4: