[发明专利]利用SPR基因dsRNA抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用SPR基因dsRNA抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖的方法，属昆虫生理和植物害虫防治技术领域。

背景技术

斜纹夜蛾Spodoptera litura (Fabricius) (Lepidoptera：Noctuidae)，是我国粮、棉、烟草、蔬菜等作物的重要害虫，且具有很强的耐药性。对于该种的防治目前主要还是采用化学防治，由于该虫的适应性及耐药性极强，在防治该虫时化学农药用量越来越高，给食品安全及环境污染问题带来严峻考验。探索绿色防治该害虫的新技术新手段已成为当前必须重视的问题。

近年来兴起的RNA干扰 (RNAi) 技术除了在基因功能研究上取得了骄人的成绩，同时也在病虫害防治上显示出了巨大的潜力。选择合适的靶基因和适当的导入方法是RNAi技术成功应用于害虫防治的关键。与害虫生存（如生长发育）与生殖（如交配产卵）等有关的关键基因是RNAi的理想靶基因。基于注射dsRNA的RNAi技术常用于基因功能研究，在害虫防治研究和实践中，害虫通过取食dsRNA（人为喷施、菌体或转基因植物产生）是较为可行的导入手段，其关键点是要明确害虫是否可通过取食dsRNA而导致靶基因沉默并影响其生存和生殖。

Yapici 等 (2008) 最先从果蝇D. melanogaster获得一个性肽受体(sex peptide receptor, SPR)， 交配过的SPR基因缺失的雌蝇与野生处女雌蝇一样只产少量卵且容易对雄性求爱产生应答，而交配过的野生雌蝇却不容易接受雄性的求爱及产卵数量开始成倍增加。随后SPR基因也在棉铃虫Helicoverpa armigera（Hanin et al. 2012）及斜纹夜蛾S. litura (Li et al. 2014)中被发现，注射RNAi表明该基因在这两种蛾类中同样调控雌性的生殖，并可能影响性信息素的合成与释放。另有研究还发现，SPR也可能是幼虫蜕皮和生长发育调节的重要基因（Yamanaka et al. 2010），因此，如果在幼虫中沉默SPR基因，有可能导致其生长发育受到抑制，进而死亡。上述这些研究中SPR的RNAi只在成虫中做过，没有在幼虫中开展过，采用的是体内表达和注射dsRNA法，并没有采用过取食dsRNA法。因此，本发明通过斜纹夜蛾幼虫和成虫取食SPR基因的dsRNA, 导致SPR基因表达沉默，从而致使斜纹夜蛾幼虫生长发育受到抑制，进而死亡，也能够导致雌性成虫交配后不产卵或只产少量卵。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种利用SPR基因dsRNA抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖的方法。

本发明通过斜纹夜蛾幼虫和成虫取食SPR基因的dsRNA, 导致SPR基因表达沉默，从而致使斜纹夜蛾幼虫生长发育受到抑制，进而死亡，也能够导致雌性成虫交配后不产卵或只产少量卵。进而抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖，也为绿色防治该害虫提供新思路和技术。

本发明的利用SPR基因dsRNA抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖的方法，其具体步骤如下：

（1）、SPR基因RNAi目标片段选择及dsRNA制备

根据NCBI数据库中登陆号为JX070670的斜纹夜蛾SPR基因的cDNA序列，通过siDirect version 2.0软件进行分析，找到一段最优RNAi目标片段，即JX070670的cDNA序列的1564 -1792碱基，长229bp，具体序列为：

5’-TAATTTCAAGCACTATAGTCGAAATTTTAGATTACTATATAGCAAACATTTTGATTCTTATAACCAATTTCTTTATCTTGGTCTCTTATCCTATTAATTTTGCTATTTACTGTGGTATGTCGAGGCAGTTTAGGGAGACGTTTAAAGAACTGTTCATTCGAGGAGCTGTTACTAGCCGTAAGAATGGCGGCTCTAGTAGATACTCCCTGGTCAACGGTCCAAGGACATG-3’

再根据这段长229bp的序列设计dsRNA制备引物一对：正向引物5’-TAATACGACTCACTATAGGGCATAATTTCAAGCACTATAGTC-3’，反向引物5’-TAATACGACTCACTATAGGGCATGTCCTTGGACCGTTGAC-3’, 其中下划线部分序列为T7启动子；