[发明专利]一种莱茵衣藻基因间表达处理元件

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种莱茵衣藻基因间表达处理元件。

技术背景

自1984年首例转基因植物烟草问世以来，向植物细胞核中转化外源基因已经成为植物基因工程中一种常规的方法。但由于外源基因在植物细胞核表达系统中表达量低下、在后代中表达不稳定、以及核基因容易随花粉扩散所带来的生态安全性等问题短期内难以克服，人们又将目光转向了核外细胞器——叶绿体。

1988年，Boynton等采用基因枪法，首次成功地将外源基因导入到莱茵衣藻的叶绿体中，并获得了外源基因稳定表达与遗传的转基因单细胞藻类，从而揭开了叶绿体基因工程的序幕。

莱茵衣藻隶属于绿藻门(Chlorophyta)衣藻属(Chlamydomonas)的单细胞真核微藻，有且仅有一个大型杯状叶绿体，细胞顶部有两根鞭毛，侧面有一个感光眼点；既能光合自养，又能依赖乙酸盐异养生长；生长速度快，细胞数量倍增时间为5～6小时，可在短时间内获得大量遗传后代。

衣藻叶绿体表达系统同细胞核表达系统相比较，具有外源基因的表达量高，可以表达原核生物多顺反子基因，外源基因能定点整合，生物安全性好，外源基因在转基因植株后代中能稳定表达以及转基因藻株可在短时间内被大规模培养且培养成本低廉等优点，因此是一种理想的外源基因表达系统。

操纵子多个基因同时表达被认为是叶绿体转化最显著的特点之一。在某些情况下已经可以成功地表达，然而，多数情况下，外源基因表达出奇的低或者不能一起表达。

IEE(intercistronic expression element)基因间表达处理元件，为一段短的序列，通常在基因间隔区，转录后可形成RNA茎环二级结构，提高调节mRNA稳定性，将多顺反子高效地处理成稳定的单顺反子，从而赋予下游顺反子的可翻译性。该确定的IEE小到足以用作一个通用的工具，用于多个外源基因堆叠的操纵子，实现多种蛋白的同时表达，从而将有助于扩大叶绿体转化技术的应用范围。

发明内容

本发明的目的是提供一种莱茵衣藻基因间表达处理元件的DNA。

实现本发明目的的技术解决方案是：一种莱茵衣藻基因间表达处理元件，序列如SEQ:1-12所示。

本发明提供的莱茵衣藻基因间表达处理元件可有效地将多顺反子处理成单顺反子。

具体实施方式

材料

莱茵衣藻

主要酶和试剂

rTaq酶(Takara)、限制性内切酶(Thermo Scientific)、质粒小提试剂盒(Axygen)、DNA凝胶纯化试剂盒(Axygen)、T4DNA连接酶(Thermo Scientific)。其余试剂均为常规试剂。

本发明中，利用NCBI检索莱茵衣藻叶绿体基因组序列，应用设计的引物，对莱茵衣藻进行PCR大规模扩增，具体实施如下：取莱茵衣藻藻液，进行基因组提取，利用基因组DNA作PCR模板。PCR程序为：95℃3min；95℃1min；49℃50s；72℃30s；72℃5min。扩增产物在1％琼脂糖凝胶跑电泳参照分子Marker鉴定大小。

引物设计如下：

IEE1

IEE1-F:5’-CGTCCAGGCGCGCCGCACCACCAACTCTGTAG-3’

IEE1-R:5’-CATGTCGACCGAGTATAAAACCACTCTGC-3’

IEE2

IEE2-F:5’-CGTCCAGGCGCGCCTATTTAATTTTTTGTAGGGCTG-3’

IEE2-R:5’-CATGTCGACATTTATTTATCCGTTAATTTTCAA-3’

IEE3

IEE3-F:5’-CGTCCAGGCGCGCCGAGTATTAACATAGGCAGTGG-3’

IEE3-R:5’-CATGTCGACGCTCCGCAGTATTAACATC-3’

IEE4

IEE4-F:5’-CGTCCAGGCGCGCCACTGCCTCCTTCGGAGT-3’