[发明专利]血管内皮细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种血管内皮细胞的培养方法，1)将多能干细胞于培养基A中分化成中内胚层前体细胞；2)将中内胚层前体细胞于培养基B中分化成血管内皮细胞祖细胞；3)将血管内皮细胞祖细胞于培养基C中分化成血管内皮细胞；培养基A含DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、糖原合成酶激酶‑3抑制剂；培养基B含DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子和转化生长因子β信号通路抑制剂；培养基C含DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子。该方法将多能干细胞分化形成血管内皮细胞。

技术领域

本发明涉及细胞的培养，具体地，涉及一种血管内皮细胞的培养方法。

背景技术

干细胞指的是能够自我更新、分裂以及分化成其它细胞类群的一种细胞。从干细胞在发育中所处的阶段来看，干细胞可以分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(adult stem cell)。胚胎干细胞是一种多能干细胞(pluripotent stemcell)，可以无限增殖并分化成人体两百多种类型细胞、形成机体的组织和器官，即能分化成多种细胞和组织的潜能的干细胞。1981年Evans和Kaufman从小鼠内细胞团(inner cellmass，ICM)分离胚胎干细胞以来，ES细胞研究成为各国科学家研究的热点，近年来围绕干细胞定向分化成其它类型细胞的研究如雨后春笋般出现(1981；Nature292(5819):154-6)。1998年Thomson成功分离、培养人类胚胎干细胞，为干细胞的人类医学应用提供了可能(1998；Science 282(5391)：1145-7)。2006年日本京都大学的山中伸弥等率先报道了iPS细胞的研究(2006；Cell126(4):663-76)，他们通过向终端分化的小鼠表皮成纤维细胞中导入四种转录因子OSKM(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc),可以诱导终端分化的细胞成干细胞状态，即iPS细胞(induced pluripotent stem cell)，此后出现了各种制造iPS细胞的技术路径。人工诱导的多能干细胞具有与胚胎干细胞相似的分化能力、表观遗传修饰和细胞形态等其他特征，为干细胞的研究提供了新的思路。

干细胞具有多种分化潜能，可以在体外长期保存，具有自我更新和无限增殖潜力。干细胞的这些特点为科学研究和医学应用提供了很好的细胞来源。目前干细胞主要研究与应用方向主要包括：1)细胞治疗，已有报道可以将干细胞定向分化成肝细胞(公告号为CN102666853A的专利)和心肌细胞(公告号为CN103602633A和CN104293730A的专利)等其他类型的细胞，为细胞治疗提供了大量的有生理功能的细胞来源；2)再生医学领域，传统再生医学如器官移植是通过供体者器官移植到受体体内，这种移植手段会产生很多问题，如免疫排斥反应和感染等。通过体外人工诱导病人自己的干细胞定向分化成成熟的具有生理功能的器官可以有效地解决这些负面效应，为再生医学提供新方法。3)药物开发，体外诱导干细胞定向分化成特定类型细胞后加入各种药物，研究药物对特定组织或细胞的毒性，节省大量研究成本，为临床应用提供大量数据。

血管是体内负责运输血液、氧气和营养物质等的重要通道，血管出现问题，可能造成组织和器官衰竭甚至坏死而危及生命，如血管内皮细胞损伤可以诱导高血压和冠心病等血管疾病的发生。心血管疾病是威胁人类健康的常见疾病，位于我国疾病发病率的首位。同时，科学研究也需要大量血管，为药物对血管组织损伤实验提供材料。另外，体外人造组织器官需要血管运输营养物质为器官生长提供养分。此外，临床和再生医学领域也迫切需要各种血管组织细胞。鉴于上述情况，如何在体外得到大量的血管组织细胞显得极为重要。多能干细胞能够为我们提供大量的种子细胞，可以定向分化成血管内皮细胞(endothelialcell)和祖细胞(endothelial progenitor cell)，从而能够为修复治疗提供大量细胞、为体外构建组织模型提供血管细胞来源，也能够为药物筛选和药物毒性研究提供很好的材料。