[发明专利]一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌以及该半乳糖苷酶的基因和应用

说明书

本发明公开一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌株，一种半乳糖苷酶以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法。该菌株分类命名为Lactobacillus casei YZ09，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2014540。本发明分离克隆到该菌株所产耐有机溶剂半乳糖苷酶的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。菌株YZ09所产半乳糖苷酶具有溶剂耐受性好、作用pH范围广、底物特异性好等性质。该半乳糖苷酶能廉价易得的乳糖为供体在非水相体系中修饰核苷类药物，具有很好的工业应用价值。

技术领域

本发明涉及一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌，其耐有机溶剂半乳糖苷酶，以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法，属于生物制药技术领域。

技术背景

叠氮胸苷、阿昔洛韦等核苷类药物是一类重要的抗肿瘤、抗病毒药物，广泛应用于临床治疗各种癌症。叠氮胸苷是第一个抗HIV病毒药物，阿昔洛韦则是目前临床上最有效的抗Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒之一，对急性视网膜坏死水痘带状疱疹病毒和EB病毒等其他疱疹病毒也有疗效。然而，叠氮胸苷由于高血浆浓度而引发较强的毒副作用，阿昔洛韦则会对血液系统、神经系统、消化系统等具有一定的毒副作用。为了获得最佳治疗效果和较小毒副作用，可以对叠氮胸苷等核苷类药物进行糖基化修饰。糖基化是一类重要的改性修饰反应，不仅会改变化合物的生物活性、水溶性、稳定性、在细胞内的运输特性、亚细胞定位以及特异性传递等特性，另外还能降低化合物的毒性。研究表明(Abram R., Aman N., vonBorstel R., et al. Cell Biophysics, 1994, 24-25(1):127-133)5-氟尿苷的半乳糖衍生物（5’-O-β-半乳糖基-5-氟尿苷）的毒副作用比母药5-氟尿苷低100倍。Bonina等(Bonina, F., Puglia, C.; Rimoli, M. G.; Avallone, L., Abignente, E.; Boatto,G.; Nieddu, M.; Meli, R.; Amorena M.; de Caprariis, P. Eur. J. Pharm. Sci.,2002, 16(3): 167-174)也报道了叠氮胸苷的半乳糖基衍生物不仅可以降低叠氮胸苷的血浆浓度，而且可以保持有效浓度更长时间，避免频繁给药。

目前，核苷糖基化衍生物主要通过化学法合成，但由于两底物中均存在多个活性羟基或氨基，化学法的选择性并不理想，所以二糖核苷的合成需要多步的保护/脱保护步骤，工艺非常复杂。而酶法糖基化一般只需一步反应，反应条件温和，具有很高的区域选择性和化学选择性。然而，有关用糖苷酶催化核苷糖基化反应的报道并不多。Binder等(Binder W.H., Kiihlig H., Schmid W. Tetrahedron:Asymmetry, 1995, 6(7):1703-1710)利用来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶通过转糖基反应催化底物对硝基苯基-β-D-半乳糖苷(pNPG)和四种天然核苷（2’-脱氧尿苷、尿苷、胸苷和腺苷）合成了一系列含半乳糖基的二糖核苷衍生物，但收率仅为3-7 %，区域选择性很差。Andreotti等(Andreotti G.,Trincone A., Giordano A. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007,47(1-2):8-32)利用来源于海洋软体动物黑指纹海兔胰腺的β-半乳糖苷酶，以邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(oNPG)为糖基供体，催化叠氮胸苷半乳糖基化生成5’-O-β-半乳糖基-叠氮胸苷，产率达到了43 %，但其对底物的转化率仅为21.5 %。颜丽强等人(Yan L Q, Li N, ZongM H. Journal of Biotechnology, 2012, 164(2):371-375)利用牛肝β-半乳糖苷酶以oNPG为供体进行了阿昔洛韦等无环核苷的半乳糖基化反应，但是对底物的转化率仅有13%，而且底物浓度仅为0.01 M。