[发明专利]脐带血单个核细胞来源的DC-CIK细胞制取方法及制剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫细胞制取和共培养方法，尤其涉及一种DC细胞和CIK细胞制取和共培养方法，DC细胞和CIK细胞均诱导和分化自脐带血分离的单个核细胞，以及在治疗肿瘤的免疫细胞制剂中的应用。

背景技术

激活T细胞有赖于2个活化信号(肽-MHC-TCR复合体、共刺激分子CD80/86与CD4⁺T淋巴细胞表达的CD28分子结合)的共同作用，刺激特异性细胞毒性T细胞(cytotoxicTcell，Tc)和辅助淋巴细胞(Thelpercell，Th)增殖，激发机体产生肿瘤免疫或是增强免疫应答能力。树突状细胞(Dendriticcell，DC)是迄今发现的功能最强的专职抗原提呈细胞(antigenpresentingcell，APC)，成熟的DC可以通过Ⅱ型组织相容性抗原(MHC-Ⅱ)等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillers，CIK)是一类抗肿瘤抗病毒效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖。DC和同源CIK细胞共培养后即可获得DC-CIK细胞。DC是机体内功能最强的抗原递呈细胞，其摄取、加工、处理抗原，高表达MHC-I、MHC-II类分子、共刺激分子及粘附分子，促进T细胞信号传导分子的相互作用以及信号通路的激活，活化的APC和T细胞可分泌IL-1，IL-2，IFN-γ等，促进T细胞效应功能的发挥。因此，如将具有强大肿瘤抗原递呈能力的DC与具有高效抗瘤活性的CIK细胞联合起来治疗恶性肿瘤，无疑会起到协同抗肿瘤作用。

现有技术中的DC制备方法多采用含有GM-CSF和IL-4的培养基连续培养5天，第6天加入TNF-α再继续培养2～3天。这种方法制备的DC细胞存在周期长、得率低和抗原递呈能力差等缺点。CIK制备方法多采用病人的外周血单个核细胞，用此种细胞制备出的CIK细胞多会存在繁殖能力差、细胞活性低、CD3⁺和CD56⁺细胞所占比例较低等问题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种DC细胞制取方法，将分离自脐带血的单个核细胞分别进行分化成DC细胞，缩短DC细胞的培养时间。

本发明的另一个目的在于提供一种DC-CIK共培养制取方法，将分离自脐带血的单个核细胞分别进行分化成DC细胞和CIK细胞后，再进行共培养。

本发明的再一个目的在于提供一种DC-CIK共培养制取方法，采用多种因子对分离自脐带血的单个核细胞进行分化制取DC细胞，缩短制取成熟DC细胞的时间，利于DC-CIK共培养的制取。

本发明提供的一种DC细胞制取方法，将分离自脐带血的单个核细胞分别进行分化成成熟的DC细胞(mDC)。mDC具有的HLA-DR、CD80、CD83和CD86表型占90％以上。

成熟的DC细胞先采用巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)和FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)等因子分化获得未成熟的DC细胞(iDC)，然后再使用肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和前列腺素E2(PGE2)作用于iDC获得成熟的DC细胞。

本发明提供的另一种DC细胞制取方法，先采用GM-CSF、IL-4和Flt3L分化分离自脐带血的单个核细胞24小时～48小时获得iDC，然后使用TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE224小时～48小时使iDC成为mDC。

本发明提供的DC细胞制取方法，GM-CSF用量为20ng/ml～30ng/ml，如：但不仅限于20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、29ng/ml和30ng/ml。

本发明提供的DC细胞制取方法，IL-4用量为10ng/ml～20ng/ml，如：但不仅限于10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml和20ng/ml。

本发明提供的DC细胞制取方法，Flt3L用量为45ng/ml～55ng/ml，如：但不仅限于45ng/ml、46ng/ml、47ng/ml、48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、51ng/ml、52ng/ml、53ng/ml、54ng/ml和55ng/ml。