[发明专利]含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于微量物质检测技术领域，尤其涉及一种含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物及其制备方法与应用。

背景技术

抗生素是一种由微生物自身产生或人工合成、低浓度下能抑制微生物生产或杀灭其他微生物的有机化学物质，除了用于人类和动物细菌性感染疾病的治疗，抗生素也被作为促长剂和饲料添加剂在集约化畜牧业和养殖业中大量应用，随着大量抗生素的使用，越来越多不能被充分吸收利用的抗生素通过人畜粪便直接排出，这些含抗生素的粪便可通过有机肥料的施用进入农田与植物之间发生迁移，此外这些抗生素有可能通过渗透、径流、淋溶等方式迁移到地表水和地下水中，重新流入环境。

目前监测抗生素残留检测方法主要有微生物法、免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。微生物法简单快速，但检测限高，特异性差；色谱检测法耗时长、在残留分离检测中，样品前处理过程复杂，并影响分析的准确度；免疫检测法简单、快速，检出限低，可进行大规模筛选，但是其相应抗体的制备需要大量实验动物，而且抗体在恶劣环境下易于失活，影响检测结果。

此外也有采用分子印迹技术萃取抗生素，然后联用色谱质谱技术进行检测，比如用分子印迹固相萃取蜂蜜中的链霉素，亲水相互作用液相色谱-串联质谱分析检测链霉素，此分子印迹方法采用沉淀聚合法合成分子印迹聚合物，需在有机相中合成，反应时间过长，而且合成的聚合物成块状，需要经过长时间的打磨、筛分才能用于固相萃取，分子印迹聚合物利用率不高，此外还需联用色谱-质谱串联技术，所需仪器贵重。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物及其制备方法与检测应用，旨在解决现有含氨基抗生素检测技术易于失活、检测结果不佳等问题。

本发明是这样实现的，一种含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)固相载体玻璃珠上引入抗生素

将250～300g玻璃珠加入到120～160mL、1～4mol/L的NaOH水溶液中，加热沸腾10～15min，取出玻璃珠用水洗至洗液的pH＝8～9，烘干得到羟基化玻璃珠；

将羟基化玻璃珠加入到150mL干甲苯中，再加入3.3mL N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺，剧烈摇动后，室温下放置过夜，过滤、丙酮冲洗，得到硅烷化玻璃珠；

将100g硅烷化玻璃珠加入到50mL、pH7.4的PBS中，再加入3.5mL戊二醛，室温下反应2～3h，抽滤，水洗，收集半成品玻璃珠；

将50mL、pH 7.4的PBS以及25mg含氨基抗生素与半成品玻璃珠混合，剧烈摇动后，室温下放置过夜，过滤、水洗，得到含氨基抗生素衍生的玻璃珠。

(2)合成抗生素印迹的纳米印迹聚合物

将1mmol N，N'-二亚甲基双丙烯酰胺、25～30mmol N-异丙基丙烯酰胺、18～20mmol N-叔丁基丙烯酰胺和0.0025～0.003mmol丙烯酸按混合并溶于100mL超纯水中，通氮气20～30分钟，将混合物倒入所述含氨基抗生素衍生的玻璃珠中，然后加入40～60mg过二硫酸铵和13～26μL四甲基乙二胺的水溶液，剧烈摇动后，室温下反应1～1.5h，反应混合物倒入至固相萃取管中，用6～8床的室温水洗涤玻璃珠，再用80～100mL、60～70热℃水淋洗，自然冷却至室温，用微孔超离心过滤装置离心分离得到含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物溶液。

本发明进一步提供了上述含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物在检测含氨基抗生素方面的应用。

优选地，所述含氨基抗生素的检测包括以下步骤：

(1)酶标物辣根过氧化物酶-模板分子HRP-T的合成

将5～10mg辣根过氧化物酶溶于0.7～1.0mL、pH6.0的MES缓冲液中，再加入0.2～0.4mgEDC和0.3～0.6mg NHS，室温下反应15min，用微孔超离心过滤装置3500rpm转速下分离除去缓冲液，用3～5mL、pH 7.40的PBS洗涤，收集活化后的辣根过氧化物酶，立即与10mL含8～10mg氨基抗生素的PBS液孵化2～3h，然后用4.0～5.0mL PBS缓冲液洗去未联接的抗生素，用微孔超离心过滤装置在转速3500rpm下分离得到酶标物HRP-T溶液；

(2)标准曲线图制作

通过酶联免疫竞争吸附法测定不同浓度含氨基抗生素的吸光度，建立抗生素浓度-吸光度的标准曲线图；

(3)含氨基抗生素的检测