[发明专利]一种1,3‑1,4‑β‑葡聚糖酶突变体

说明书

技术领域

本发明涉及一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

β-葡聚糖是存在于禾本科植物细胞壁的一种非淀粉性多糖，在大麦、小麦、大米等经济类谷物中含量很高。其是由高达上千个β-D-葡萄糖残基通过β-1,3或β-1,4糖苷键线状排列而成，具有很高的分子量。其可以溶解于水中，形成的溶液黏度很高，这给啤酒行业及饲料行业带来了诸多不利。在啤酒工业的主要原料麦芽中含有大量β-葡聚糖，未降解的β-葡聚糖存在于麦汁中会导致麦汁黏度过大，造成过滤困难，延长麦醪过滤时间，降低浸出物含量，对于成品啤酒会影响其非生物稳定性。而在生产纯生啤酒时，过多β-葡聚糖酶会造成滤膜的膜孔堵塞，过滤能力下降。在饲料行业中，麦类饲料中的β-葡聚糖无论在人的肠道还是动物的肠道内都不能被直接消化吸收，必须经过酶促降解后才能被利用，且其阻止了有效成分在动物肠道中内的吸收，降低了饲料中有效成分转化率，是一种抗营养因子，并为微生物特别是致病菌的寄居繁殖提供了丰富的营养造成大量有害微生物在动物肠道内繁殖，引起畜禽腹泻，同时会竞争性消耗大量物质而降低饲料利用率。

来源于特基拉芽孢杆菌(B.terquilensis)CGX 5-1的1,3-1,4-β-葡聚糖酶，简称β-葡聚糖酶。1,3-1,4-β-葡聚糖酶是一类可以在3-O-吡喃葡萄糖位点专一性切割β-葡聚糖为三糖和四糖，这是其工业应用的基础。在啤酒行业麦汁糖化过程中温度是从48℃提高至78℃，而饲料行业中烘焙的温度也在65℃以上。而目前筛选得到的大部分野生1,3-1,4-β-葡聚糖酶的最适温度主要集中在45℃和55℃，并不能满足工业上的需求。而催化活性不高也是其不能推广使用的重要原因。而目前市场上几家酶制剂公司如诺维信、DMS研发生产的β-葡聚糖酶制剂价格昂贵，而目前国内也有部分酶制剂公司生产β-葡聚糖酶制剂，但其水平远不及国外酶制剂公司，且β-葡聚糖酶制剂的生产菌种及工艺都是商业机密，国内研发速率缓慢，因此国内市场在很大程度上依然依赖进口。因此，如果能够提高野生型1,3-1,4-β-葡聚糖酶的催化活性及热稳定性，获得高活性高热稳定的β-葡聚糖酶，那么就可以降低成本，推广其在工业上的应用。

为了提高1,3-1,4-β-葡聚糖酶的热稳定性，国内外已经进行了一些研究。目前研究发现，1,3-1,4-β-葡聚糖酶中唯一存在的一对二硫键对于蛋白质热稳定性影响不大。而GLN1、THR2、SER5和PHE7的突变大幅度的提高了β-葡聚糖酶的热稳定性。对β-葡聚糖酶的杂交结果显示，将来源于浸麻芽孢杆菌(B.macerans)的前16个氨基酸替换为淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的前16个氨基酸得到的杂交酶H(A16-M)和两者之间前12个氨基酸进行替换及删除TYR13形成的杂交酶H(A12-M)-△13在高温下有很好的稳定性。这说明β-葡聚糖酶的N端对于该酶的热稳定性有重要的影响。而钙离子对于在高温下维持β-葡聚糖酶的稳定性也有重要作用。针对β-葡聚糖酶中多有赖氨酸进行定点突变研究发现当其中3个赖氨酸突变为丝氨酸得到的三突变酶(BglTM)的热稳定性和催化活力都有了一定程度的提升。但是目前得到的改造酶BglTM的热稳定性依旧不能适应工业应用。

本发明所使用的经过改造的特基拉芽孢杆菌CGX 5-1来源的1,3-1,4-β-葡聚糖酶(BglTM)的最适温度为60℃，比活力为3936.4U/mg，并不能适应工业应用的要求。因此，进一步提高该酶的催化活力及热稳定性对其在工业上的应用推广有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，尤其是一种具有更高热稳定性的1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体。所述突变体是通过对亲本1,3-1,4-β-葡聚糖酶(BglTM)表面进行二硫键改造得到的。

所述突变体，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，分别命名为N31C-T187C、P102C-N125C、N31C-T187C/P102C-N125C。