[发明专利]一种CYP2C19*17基因多态性SNaPshot检测方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因多态性检测领域，具体涉及一种CYP2C19*17基因多态性SNaPshot检测方法与应用。

背景技术

肝脏是人体重要的解毒器官，许多药物都经肝脏代谢，细胞色素P450 (cytochrome P450 )是主要的肝细胞Ⅰ相代谢酶之一。在CYP2C亚家族中，CYP2C19亚型对药物反应起着关键性的作用，因为它们的活性存在显著的个体差异，表现为遗传多态性，从而产生血药浓度的个体差异。CYP2C19酶广泛分布于肝、肾、脑、皮肤、肺、胃肠道及胎盘等组织器官，主要在肝脏。其参与多种外源性物质代谢如：药物、酒精、抗氧化剂、有机溶剂、染料、环境污染物质等。从理论上讲，所有的药物代谢酶都具有遗传多态性。绝大多数药物代谢酶的多态性是一种单基因多态性，是由于同一基因位点上具有多个等位基因引起的。遗传学的改变使CYP450酶表现出遗传多态性，并且具有明显个体、种族或地域差异。

等位基因编码的代谢酶具有不同的代谢能力：正常野生型表现为快代谢型(EM)；绝大多数突变型等位基因，因碱基的突变、插入或缺失而造成酶代谢能力降低，表现为慢代谢型(PM)，这对治疗的个体反应和药物毒副作用都产生重要影响。

CYP2C19至少存在14种突变基因和18种等位基因突变。编码正常酶活性的基因是CYP2C19*1，CYP2C19等位基因主要是*1，*2，*3……*17。而CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因占东方人弱代谢表型(PM)的99％以上。*2，*3等位基因编码的酶无活性，CYP2C19*2 等位基因变异的外显子5第681位处的碱基发生变异(G/A)形成了一个异常剪接点，使得转录时在外显子5的始端丢失了40个碱基对(643-682bp)，从而在翻译时丢失了215-227位氨基酸，使215位氨基酸开头的阅读框架发生移动，因此在215位氨基酸下游第20个氨基酸处提前产生1个终止密码，使蛋白合成过早被终止，结果使这一截短的含234个氨基酸的蛋白质丧失了催化活性。由此导致的慢代谢在中国人中的发生率约为30%。CYP2C19*3等位基因是在外显子4第636位发生G/A突变，产生了提前的终止密码，蛋白合成终止，使CYP2C19酶活性丧失。通过该酶代谢的药物（如质子泵抑制剂，抗惊厥药等）随患者基因型不同，其疗效和副作用也有明显不同。

目前常用的对基因多态性位点检测的方法有Sanger测序及AS-PCR+琼脂糖凝胶电泳,Sanger测序的方法检测基因多肽性位点成本相对较高，AS-PCR+琼脂糖凝胶电泳的方法检测多态性位点灵敏性相对较低。因此需要开发一种成本相对较低，同时灵敏性好，准确度与精密度高的基因多态性位点检测方法。

发明内容

本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种CYP2C19*17基因多态性SNaPshot检测方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一种CYP2C19*17基因多态性SNaPshot检测方法，其包括如下步骤：首先提取血液基因组DNA，将其稀释至100μg/mL后通过PCR扩增CYP2C19*17的序列，PCR扩增产物纯化后将对应的序列进行SNaPshotPCR扩增，扩增产物纯化后通过毛细管电泳法检测荧光信号并通过软件分析SNP位点，通过不同的荧光检测结果确定检测 SNP 位点处碱基变化确定基因型。

作为本发明所优选的一种实施方式，所述的检测方法，具体包括如下步骤：

1）DNA提取：提取方法参照TIANampBloodDNAkit(购自Tiagen，货号DP318)的说明书，提取完毕的DNA计算其浓度并稀释至100μg/mL；

2）PCR扩增CYP2C19*17的序列：PCR反应体系中组分及体积份数分别为Q5^?Master Mix12.5份，双蒸水8.5份，，ward1份，Reverse1份；准确量取PCR反应体系23μL，向其中加入2μL稀释后DNA模板；置PCR管放于PCR仪上并将反应程序设置如下：1：98℃，3 min；2：98℃，10 sec；3：58℃，30 sec；4：72℃，1 min；5：往复进行35个循环 ；6：72℃，5 min；7：25℃ ；

3）PCR扩增产物纯化：取2体积份的ExoSAP-IT和3体积份的ddH2O混合配制酶混合物，按5μL分装到新的8连管中，每管加入PCR扩增产物2μL，混匀微离心，按以下程序进行反应：1：37℃,15 min ；2：80℃,15 min 3：4℃；