[发明专利]一株噬菌体抗性L‑天冬氨酸转化菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株具有噬菌体抗性的l-天冬氨酸生产菌，是一种新的菌株品种，属于生物工程技术领域。

背景技术

l-天冬氨酸是一种重要的氨基酸，是生产阿斯巴甜、聚天冬氨酸、l-丙氨酸等化合物的主要原料，全球年需求量约30万吨，市场需求巨大（Lee KM, et al. J Org Chem. 1989, 54:3195–3198）。微生物转化法利用产l-天冬氨酸酶的菌种转化富马酸铵生产l-天冬氨酸，与物理或者化学生产方法相比，具有反应条件温和、转化率高、副产物少等优点，是目前广泛使用的规模化生产方法（盛晓燕, 等. 食品科技. 2010, 35:23−26.）。

微生物工业规模生产l-天冬氨酸中的噬菌体污染是一个常见现象，容易造成发酵周期的延长，发酵底物消耗和产物形成变慢，影响发酵产品的产量和质量，甚至造成发酵的中止导致发酵失败，给生产造成巨大损失，成为制约产品产能稳定和品质提升的关键因素之一（孙文敬, 等. 食品科技. 2013, 38:323–327; 周海岩, 等. 食品与发酵工业. 2013, 39:88–93）。选育噬菌体抗性的生产菌种是解决这一问题的有效途径之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的菌株品种，具有噬菌体CICC 80001抗性，且可以产l-天冬氨酸酶，转化富马酸生产l-天冬氨酸。

本发明所要解决的技术问题是提供一株大肠埃希氏菌菌种CICC 11021S，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.9850。该菌种具有对噬菌体CICC 80001的抗性。噬菌体CICC 80001可以从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买获取。

所述抗噬菌体l-天冬氨酸生产菌种，其优选培养基组成为：

（1）种子培养基

LB培养基（g/L）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化钠10.0，pH 7.0 – 7.2，固体培养基添加2%的琼脂粉。

（2）发酵培养基

牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：玉米浆干粉 13.0，硫酸镁 0.2，磷酸二氢钾 1.0，氯化钠 1.5，富马酸 5.0，葡萄糖 5.0，pH 6.5 – 7.0。

所述具有l-天冬氨酸酶活力且抗噬菌体的菌种，其活化方法为：

用接种环从大肠埃希氏菌菌种CICC 11021S斜面刮取少量菌种，接入装有100 mL LB培养基的500 mL三角瓶中，37^oC，200 rpm条件下培养8 – 16小时，获得种子液。

所述具有l-天冬氨酸酶活力且抗噬菌体的菌种，其发酵罐培养方法为：

将种子液以1‰ – 5%的接种量接入5 L发酵罐中，发酵培养基体积为2.0 – 4.0 L，通气量0.5 – 1.5 vvm，搅拌转速为200 – 500 rpm，培养8 – 16小时。

所述具有l-天冬氨酸酶活力且抗噬菌体的菌种，其l-天冬氨酸转化罐转化生产方法为：

配置富马酸溶液，用氨水调节pH，至转化体系富马酸终浓度为0.8 – 1.2 M，pH为7.7 – 8.0，加入发酵液。40 – 50^oC，搅拌转速30 – 100 rpm，转化8 – 16小时。转化生成的l-天冬氨酸经脱色、过滤、结晶、干燥得成品。l-天冬氨酸测定方法采用氨基酸常用测定方法——高效液相色谱（High performance liquid chromatography, HPLC）柱前衍生方法（Hender JW, et al., Rapid, accurate, sensitive and reproducible HPLC analysis of amino acids. Agilent Technologies. USA. 2000）。

有益效果：

本发明提供一株具有噬菌体抗性的l-天冬氨酸生产菌种，与之前的l-天冬氨酸生产菌种相比，可以有效抵抗噬菌体CICC 80001的污染，并且细胞生长速率良好，遗传稳定性好，有效提高了l-天冬氨酸生产企业的经济效益。

微生物保藏信息

微生物分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）

保藏编号：CGMCC No.9850

保藏日期：2014年10月27日；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；