[发明专利]一种rhIL-10重组载体构建及其蛋白提纯的方法

说明书

一种hIL‑10重组载体，采用IMPACT系统表达，其融合蛋白标签为6个组氨酸(6×His)的重组载体，如重组载体的质粒图谱所示；重组载体的构建、表达及鉴定方法步骤包括：1)rh‑IL10基因的扩增；2)重组载体的构建、表达及其鉴定；rh‑IL10融合蛋白的纯化方法步骤为：1)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的粗提；2)包涵体洗涤；3)包涵体溶解；4)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的纯化；5)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的复性及自切割；6)IL10‑RGD纯化；增加了hIL‑10在体内的靶向性，赋予了蛋白具有抗肿瘤以及机体免疫功能的活性，更为重要的是其在伤口愈合过程中能够与新生血管内皮细胞特异靶向结合，从而预防抑制瘢痕纤维化的形成。

技术领域

本发明属于基因工程及蛋白纯化技术领域，具体涉及一种rhIL-10重组载体构建及其蛋白提纯的方法。

背景技术

在体外将目的基因与载体结合成一具有自我复制能力的重组体，继而通过转化大肠杆菌，筛选出含有目的基因的转化子细菌，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，即重组克隆或表达载体的构建。构建完毕的质粒可进行酶切及测序鉴定，得到与目的基因相符且没有突变的重组载体，将其转化大肠杆菌感受态进行诱导表达。蛋白诱导表达后进行分离纯化，鉴于rhIL-10在非融合系统中表达量低或不表达，因此后期采用融合系统进行诱导表达，并成功创新性的利用了IMPACT表达系统，分离纯化得到rhIL-10。

白细胞介素10(IL10)是由多种细胞产生并作用于多种细胞的免疫调节细胞因子，其功能包括免疫抑制和免疫促进两方面，可调节多种免疫细胞的分化和增殖，同时也具有调节免疫刺激的特性。

RGD多肽(CDCRGDCFC，9肽)能够特异性结合在成体中相对缺乏的αvβ3、αvβ5整合素，此两种整合素在血管发生中会选择性上调升高，因此，RGD是新生血管内皮细胞特异性识别并结合的多肽序列。将新生血管内皮特异性结合的RGD导向肽与IL-10融合表达，可以降低用药剂量及治疗成本，减用药带来的毒副作用；同时在体内能够使IL-10药物定向作用于血管内皮细胞而发挥药理作用。

发明内容

为克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种rhIL-10重组载体构建及其蛋白提纯的方法，建立了适宜重组蛋白rhIL-10的表达载体，并利用此表达载体进行目的蛋白的纯化，检测其具有生物活性；该重组蛋白增加了hIL-10在体内的靶向性，赋予了蛋白具有抗肿瘤以及机体免疫功能的活性，更为重要的是其在伤口愈合过程中能够与新生血管内皮细胞特异靶向结合，从而预防抑制瘢痕纤维化的形成。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种hIL-10重组载体，其特征在于，采用IMPACT系统表达，其融合蛋白标签为6个组氨酸(6×His)的重组载体，如重组载体的质粒图谱所示。

一种hIL-10重组载体的构建、表达及鉴定方法，包括以下步骤：

(一)rh-IL10基因的扩增

1)总RNA的提取

正常人外周血经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗涤2次，重悬于10％PRMI1640培养液，加入终浓度为10g/L的ConA，置5％CO₂培养箱，37℃培养48h，收集细胞，根据Sigma RNA抽提试剂盒方法，提取总RNA，-80℃保存备用；

2)RNA反转录及IL-10 cDNA的扩增