[发明专利]一种刀豆球蛋白A的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于化学发光技术领域，涉及一种刀豆球蛋白A的测定方法。

背景技术

刀豆球蛋白A(Con A)，又名刀豆凝集素、刀豆素，是一种植物血凝素，具有强力的促有丝分裂作用，有较好的促淋巴细胞转化反应的作用，其促淋巴细胞转化最适浓度为40-100μg/ml，能沉淀肝糖原，凝集羊、马、狗、兔、猪、大鼠、小鼠、豚鼠等动物及人红细胞。还能选择性激活抑制性T细胞(Ts细胞)，对调节机体免疫反应具有重要作用。因此，通过使用Con A来活化病态(或老年)时的Ts细胞这一途径，可望改观一些自身免疫性疾病，甚或在移植物排斥反应或恶性肿瘤的防治方面具有广泛的应用前景。近年来刀豆球蛋白A测定方法主要有：凝集抑制试验法(Carrotta R,Vilasi S,Librizzi F,Martorana V,Bulone D,San Biagio PL.Entrapment of Aβ1-40peptide in unstructured aggregates.J Phys Chem B 2012,116(50):14700-12707)；表面等离子体共振法(Bellapadrona G,Tesler AB,Grünstein D,Hossain LH,Kikkeri R,Seeberger PH,Vaskevich A,Rubinstein I.Optimization of localized surface plasmon resonance transducers for studying carbohydrate-protein interactions.Anal Chem.2012,84(1):232-240)；散射光测定法(Babu P,Sinha S,Surolia A.Sugar-quantum dot conjugates for a selective and sensitive detection of lectins.Bioconjug Chem.2007,18(1):146-151)；等温滴定量热法(Wang X,Matei E,Gronenborn AM, O,Yan M.Direct measurement of glyconanoparticles and lectin interactions by isothermal titration calorimetry.Anal Chem.2012,84(10):4248-4252.)；电化学(Liu BQ,Zhang B,Chen GN,Yang HH,Tang DP.Proximity ligation assay with three-way junction-induced rolling circle amplification for ultrasensitive electronic monitoring of Concanavalin A.Anal Chem.2014,86:86,7773-7781.)等。但是，这些方法的各有其缺点，本发明利用磁珠为载体，以异硫氰酸荧光素FITC为标记物，以光诱导化学发光原理，实现了刀豆球蛋白A的测定，具有方法简单、成本低、灵敏度高的优点。

发明内容

本发明目的是提供一种灵敏的测定刀豆球蛋白A的新方法，利用磁珠为载体，以FITC为标记物，实现刀豆球蛋白A的测定。

技术方案

本发明是基于刀豆蛋白A识别氨基葡萄糖修饰磁性微球链式杂交反应原理测定刀豆蛋白A的方法。在目标物刀豆蛋白A存在时，标记有不同DNA链的磁性微球相互靠近，磁性微球表面修饰的DNA发生杂交反应，然后，再与修饰有异硫氰酸荧光素FITC的发卡DNA：FITC-H1和FITC-H2进行杂交链式反应，利用光二极管诱导化学发光原理，根据化学发光强度，实现对刀豆蛋白A的测定。其特征为：

a.将发卡DNA在使用之前孵化，然后，逐步降温至室温；

b.取羧基化磁珠至小离心管中，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，并分散到Tris-HCl缓冲溶液中；

c.将N-(3-(二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入步骤b中处理好的磁珠溶液中，将该混合物在室温下轻摇1h；

d.将氨基化葡萄糖水溶液和DNA1加入步骤c所得溶液中，在4℃条件下，振动12h，反应完成后，将所得产物GA-MB-DNA1经过磁性分离，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，再分散到Tris-HCl缓冲溶液中；