[发明专利]一种铁皮石斛药用原球茎大型生物反应器克隆生产工艺

说明书

技术领域

本发明公开一种铁皮石斛药用原球茎大型生物反应器克隆生产工艺，属于生物工程技术领域。

背景技术

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kmuraet Migo）是我国传统名贵中药材，味甘，性微寒，具有生津养胃、滋阴清热、润肺益肾、明目强腰等功效。唐代开元年间的《道藏》把：“铁皮石斛、天山雪莲、三两重的人参、百二十年的首乌、花甲之茯苓、苁蓉、深山灵芝、海底珍珠、冬虫夏草”并称为中华九大仙草。根据国家药典记载，其主要药效成份为石斛多糖和石斛碱。

由于铁皮石斛可观的经济效益，亩产收益可达10万元以上，这也吸引了越来越多的种植户投身于铁皮石斛的种植行业中来，就具体种植面积而言，全国集约化种植(大棚内种植)面积已超10万亩。而全国中药材种植用地目前已经高达惊人的12000万亩（占到全国粮食总种植面积的1/10）,这也导致了更多的粮食种植用地进一步被占用、粮食减产、粮食储量得不到保障、粮食价格不稳定等关乎民生的危情出现。

另外由于铁皮石斛种植周期长，一般需要三到四年时间才可以采收，一些不法商家以其他生长较快且药效一般的石斛品种仿冒铁皮石斛进行高价售卖，歁骗消费者，扰乱了市场。此外，在铁皮石斛的种植过程中由于大量使用农药、激素、化肥和未经净化处理过的水源等，导致铁皮石斛受到重金属、农药、激素等的污染，这不但影响了铁皮石斛品质，也会随患者食用铁皮石斛后进入体内，导致各种慢性疾病的发生。

铁皮石斛药用原球茎是由铁皮石斛果荚中的种胚微粒经液体克隆形成球茎原胚体，该阶段，可通过营养调节和特殊的培养条诱导使原球茎富集了大量的初生和次生代谢产物，其中石斛碱、毛兰素和多糖的含量均为其整个生长过程中最高的阶段。

铁皮石斛原球茎已被证实与原药材铁皮枫斗和鲜条等具有同等的药用价值，卫计委也拟将铁皮石斛原球茎列入新食品原料目录中。然而，由于原球茎生长的特殊性，如球茎个体大，是单一细胞团的1600倍；对通气量、光照强度和对温度敏感；对培养基的营养成份要求较高；生长周期长等。上述因素极大地限制了铁皮石斛原球茎的大规模工厂化生产，影响了铁皮石斛产业的快速发展。本发明基于上述问题的不断研究和探素，成功开发出应用于原球茎工厂化生产的大型生物反应器和生产工艺。

本发明的实际应用可以有效地解决上述问题，应用150升植物细胞生物反应的克隆生产工艺，可实现年产量达1000公斤/罐的药用原球茎，这相当于传统种植10亩地的年平均产量，且单批次生产周期仅为两个月，是传统种植的1/12。本发明专利的生产过程是隔离式无菌培养，所收获的原球茎均无激素残留、农药残留、重金属污染、有害元素污染。与传统原球球茎组培相比，本发明具有生产规模大，生产成本低，石斛药效成份表达稳定、表达量高，克隆生产全程可控，产品安全系数高。

发明内容

本发明的任务是在于提供一种铁皮石斛药用原球茎大型生物反应器克隆生产工艺，旨在保证原球茎药用价值的同时实现大规模工厂化生产，包括以下步骤。

1）选用人工种植的铁皮石斛成熟果荚，果荚饱满，青绿或绿紫色，采收于十月至十一月期间，先用干燥纸巾包裹好，放入存有干燥剂的带盖玻璃瓶，低温4℃下处理3天后，取出用手术刀片将果荚的多余部份切除，只留1～2cm长的果柄，称重并记录。果荚先用酒精棉球擦拭表面，于5~10%次氯酸钠处理10~20min，无菌水冲洗3~5次，然后浸入70~75%酒精中30s~1min，无菌水冲洗3~5次，置于接种盘中切开果荚底部，均匀地播入装有种子液体培养基的通气培养瓶中。

其中种子液体培养基的配方为1/2改良MS、4%蔗糖、15%马铃薯提取汁、pH5.5，其中1/2改良MS的配方为：销酸铵和氯化钙减半，其他不变。培养条件为光照2600Lux，温度25℃，通气1m3/min，培养45天后即可准备接入大型生物反应器。

2）种胚微粒诱导萌发，得到原球茎种子，配制克隆生产培养基和补料培养基，转入150升植物细胞反应器中，在位灭菌后将原球茎种子接入，接种量为：15g/L，先后进行暗培养和光照培养，完成培养收集原球茎后进行称重换算增殖系数。

其中，原球茎克隆生产培养基的配方为：改良MS、2%蔗糖、1%葡萄糖、15%马铃薯提取汁、NAA 1mg/L，补料本方为：克隆培养基浓缩10倍；接种量为：15g/L；暗培养的参数为：温度25℃、通气2m3/min、转速120转/min、pH5.5、周期15天；光照培养的参数为温度27℃、通气4m3/min、转速150转/min、pH5.5、周期25天，每隔7天进行一次补料。