[发明专利]通过过量表达原人参二醇合成酶基因提高人参发根中人参皂苷含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及人参原人参二醇合成酶基因D12H，植物过量表达载体pBI21-D12H，一种通过过量表达人参基因D12H使人参发根中人参皂苷含量提高的方法。

背景技术

人参是药用植物，具有补脾益肺，安神明目等多种功效。人参中的主要生理活性物质为人参皂苷，人参皂苷为人参的次生代谢物质，具有广泛的药理活性，对多种疾病有显著的疗效，人参皂苷具有很高的药用价值。但是，人参皂苷的主要来源是从植物体中提取，现在野生的人参非常稀少，人工栽培的人参生长周期长，人参培育过程遭到病虫的危害也较多，影响了人参培育的品质，自然生长的人参中人参皂苷的含量较低，这些因素都限制了人参皂苷的开发与利用。近些年来国内外的学者通过组织培养、生物转化、微生物合成等方法进行人参皂苷合成研究，均取得了一定的研究成果。基因工程等技术的发展与应用，对进行人参品种改良和人参的种质资源创新具有重要意义。上世纪八十年代，首次成功诱导人参产生发根，获得的人参发根，生长稳定，生长速度快，为基因工程改良人参品质以提高人参皂苷含量奠定了基础。近几年对人参皂苷的合成途径不断进行研究，成功的确定和克隆出人参皂苷合成过程中的关键酶基因，人们利用代谢工程和基因工程手段对这些关键酶基因进行处理，调控人参皂苷合成途径，以获得的更多的人参皂苷。

目前，已经确认的多种人参单体皂苷，其中三萜类皂苷为主要成分。研究表明，人参皂苷的共同前体为2，3-氧化角鲨烯，其通过多种酶的共同作用生成种类众多的单体皂苷。其生物合成路线为甲羟戊酸(MVA)途径生成的IPP及其异构化的DMAPP在牛儿基焦磷酸合成酶(GPS)作用下首先形成牛儿基焦磷酸(GPP)，接着利用法尼基焦磷酸合成酶(FPS)转化成法尼基焦磷酸(FPP)，又在鲨烯合成酶(SS)等的作用下合成鲨烯，然后经鲨烯环氧酶(SE)催化转变为2，3-氧化鲨烯。2，3-氧化角鲨烯流向三条不同的代谢途径，其一是在达玛烯二醇合成酶、原人参二醇合成酶的作用下生成达玛烷型皂苷；其二是在β-香树素合成酶的作用下生成齐墩果烷型皂苷；另一条在环阿乔醇合成酶的作用下合成植物甾醇。在众多人参皂苷中只有一种齐墩果烷型皂苷-Ro，其他人参单体皂苷均为达玛烷型皂苷，因此，达玛烷型人参皂苷合成酶基因为关键酶基因，其表达水平决定人参皂苷的含量。

发明内容

本发明首先克隆人参原人参二醇合成酶(或称达玛烯二醇12-羟化酶，Dammarenediol-12-hydroxylase，D12H)基因D12H，构建人参基因D12H过量表达载体，对人参进行遗传转化，诱导出人参发根，通过对人参发根中人参皂苷含量的分析，证明过量表达人参原人参二醇合成酶基因D12H可提高人参中主要人参三萜类皂苷的含量。

本发明利用植物双元表达载体pBI121质粒，该表达载体有强启动子CaMV35S，该启动子由TATA盒、CAAT盒、倒转重复序列和增强子核心序列四部分组成。

构建人参基因D12H植物过量表达载体pBI121-D12H重组质粒。

将重组质粒pBI121-D12H转化发根农杆菌A4，获得工程菌A4-pBI121-D12H。

利用植物过量表达工程菌A4-pBI121-D12H侵染人参根片，诱导出过量表达D12H且人参皂苷产量提高的人参发根系Pg-pBI121-D12H，从而实现通过过量表达人参皂苷合成关键酶基因从而提高人参皂苷含量的目的。

附图说明

图1是人参基因D12HPCR扩增后电泳图。

图2是重组质粒pBI121-D12H的菌落PCR鉴定电泳图。

图3是重组质粒pBI121-D12H双酶切鉴定电泳图。

图4是过量表达工程菌A4-pBI121-D12H菌落PCR电泳图。其中：

1：A4-pBI121-D12H；2：阴性对照组。

图5是诱导成功的人参发根Pg-pBI121-D12H。

图6是人参发根Pg-pBI121-D12H的鉴定图。其中：1：Pg-pBI121-D12H的NPTⅡ扩增；2：pBI121的NPTⅡ扩增。

图7是人参皂苷标准品HPLC图。

图8是对照组人参发根与过量表达组人参发根Pg-pBI121-D12H人参皂苷含量对比图。其中：a：对照组；b：过量表达组Pg-pBI121-D12H。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。