[发明专利]两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系及其分离方法和应用

权利要求书

1.两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系，其特征在于，是通过以下方法分离得到的：

(1)、取用刚切除的乳腺癌肿瘤标本，先经胶原酶消化处理，再过滤；

(2)、流式细胞仪分选出CD44⁺,CD24^-和ALDH1⁺的细胞，调节要求细胞纯度在98％以上；

(3)、配置乳腺癌干细胞培养剂，将步骤(2)中分选出的细胞经单克隆筛选后接种于含有乳腺癌干细胞培养剂的超低粘附的培养皿中，在原代培养中加入青霉素及链霉素双抗，于CO₂培养箱培养即得到两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系。

2.根据权利要求1所述的两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系，其特征在于，步骤(1)所述的经胶原酶消化处理，具体是使用胶原酶III，每毫升组织液中加入250单位胶原酶III，再置于37℃恒温培养箱中培养4小时。

3.根据权利要求1所述的两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系，其特征在于，步骤(1)所述的过滤，为使用40mm滤网进行过滤。

4.根据权利要求1所述的两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系，其特征在于，步骤(2)所述的乳腺癌干细胞培养剂，其配方为：在无血清DMEM-F12中加入10ng/mL碱性成纤维生长因子、20ng/mL表皮生长因子、2％B27及5ug/mL胰岛素。

5.根据权利要求1所述的两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系，其特征在于，步骤(2)所述的单克隆筛选，方法为：按重度1：2有限稀释法稀释至单一细胞，并将细胞分散滴加于96孔板中，显微镜下观察确认为单一细胞者进一步培养。

6.根据权利要求1所述的两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系，其特征在于，步骤(3)中所述的青霉素，其添加量为100U/mL，所述的链霉素，其添加量为0.1mg/mL。

7.根据权利要求1所述的两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系，其特征在于，步骤(3)所述的CO₂培养箱为5％CO₂培养箱。

8.权利要求1所述的在两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系制备治疗乳腺癌药物中的应用。