[发明专利]一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒。

背景技术

玉米青枯病是我国玉米生产上最重要的病害之一。该病的发生引起玉米平均减产5％～20％，严重发生区域可达100％。玉米青枯病的发生可以引起玉米灌浆困难、茎秆折断，进而引起玉米产量降低和影响玉米机械化收割，在连阴多雨的年份表现尤为明显。在我国，玉米青枯病病原菌主要有：肿囊腐霉(Pythium inflatum)、禾生腐霉(P.graminicola)，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和轮枝镰刀菌(F.verticillioides)。在我国最大的玉米产区黄淮海玉米带，自1994年至今，肿囊腐霉一直是引起玉米青枯病的优势病原菌。然而，至今未见对肿囊腐霉玉米青枯病有防治效果的杀菌剂，这主要是由于该病原菌次年作为初侵染源的越冬孢子(卵孢子)具有约2μm厚的细胞壁。由于生产上缺乏抗病的品种，玉米青枯病一直是玉米生产上的主要问题，因此，开发出一种高效快捷的肿囊腐霉检测方法，在玉米种植前，对土壤中的病菌进行动态监测，显得尤为重要。

肿囊腐霉所在的腐霉属包括140个确定的种。卵器、卵孢子、雄器和孢子囊的大小和形状一度被科学家用来作为腐霉菌形态学鉴定的标准。然而，以形态学特征作为腐霉菌的分类依据往往不准确，也费时费力，这是由于形态学特征在不同的培养条件下会产生变化，或同一种也会产生表型差异；此外，一些腐霉菌之间存在形态相似性。特别地，肿囊腐霉和近缘的禾生腐霉在形态上和生态型上都非常相似，因此，通过形态学特征对腐霉菌进行种类划分往往无法进行下去。

近年来，腐霉菌的核酸检测方法包括PCR、增强型PCR(booster PCR)、多重PCR、实时PCR(real-time PCR)、PCR-限制性片段长度多态性、DNA寡核苷酸阵列和环等温介导扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等基于PCR的DNA扩增技术。这些反应往往通过特异性的引物对核糖体DNA内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)、细胞色素氧化酶II基因、β-微管蛋白基因的靶片段进行扩增。现有的肿囊腐霉检测方法主要基于booster PCR。这些检测手段是分析腐霉菌潜在侵染或早期侵染的有效方法。然而，这些检测方法往往需要在实验室使用昂贵的仪器设备，耗费大量时间按照固定的流程进行操作。此外，这些检测方法中设计的特异性引物并不能将肿囊腐霉与其近缘种(如禾生腐霉)有效地区分开。

除了real-time PCR、booster PCR等可以用于定量检测腐霉菌等土壤病原菌。实时荧光环介导等温扩增(real-time fluorescence LAMP,RealAmp)是一种可替代的用于检测土壤病原菌的检测方法。

LAMP是2000年由日本的研究人员Notomi等人发明的一种新型核酸扩增技术。该技术主要是针对目标DNA的6个区域设计4条(特异性)引物，再利用一种链置换聚合酶(Bst DNA聚合酶)在(恒温条件)下保温1h-2h，即可完成核酸扩增反应。在LAMP反应中，不需要通过热变性将双链DNA变成单链。因为双链DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一条引物与双链DNA的互补部位进行碱基互补配对，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸，另一条链就会脱落变成单链。LAMP方法正是利用这一特点进行反应的。该方法克服了传统PCR反复热变性的缺点，并大大节省了反应时间，从而实现在恒温条件下进行连续的快速扩增，其灵敏度比PCR高出1～2个数量级。同时因为两对引物针对靶基因的6个区域，从而使LAMP具有较好的特异性，该技术可以在30min到1h内扩增出10⁹～10¹⁰拷贝数。

LAMP反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳，或伴随反应产生的焦磷酸酶沉淀，也可以通过反应液中加入的染料在反应前后颜色的变化，通过测流装置检测反应中或反应完成后整合到扩增产物中的特定标签进行检测，判断是否有靶标片段扩增。