[发明专利]分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7、由该细胞株分泌的单克隆抗体及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由该细胞株分泌的识别不同抗原表位的单克隆抗体及其应用。

背景技术

目前，犬腺病毒已知血清型是1型和2型。1962年，Dltehfleld从患呼吸道疾病的小狗中分离出犬喉气管炎病毒(即CAV-2)，该毒株与1954年Cabass分离的犬传染性肝炎病毒(CAV-1)在血清学上既相关，但又有明显的差别。

Ditchfleld等经研究已证明CAV-1和CAV-2在毒力、可溶性、抗原结构及红细胞凝集范围方面的区别。但后来1型腺病毒也可引起单纯的呼吸道疾病，所以CAV-2可以认为是CAV-1的变异株，经CAV-2免疫的犬能有效地产生针对CAV-1强毒的免疫力。到目前为止，国外已陆续分离获得多株犬的1型、2型腺病毒，并且在犬和红狐里的携带和发病率较高。国内关于CAV-2病毒的分离报道相对较少，而CAV-2通常被认为是由CAV-1遗传衍化而来，因此，研究犬2型腺病毒对于犬的多种疾病的预防与控制具有重要意义。通常分离到的犬2型腺病毒毒力较弱，相关研究主要集中在其作为载体的应用，而其致病性的研究相对较少。然而正如禽流感、马传贫、马立克氏等病毒不断遗传一样，犬腺病毒也在不断变异。犬腺病毒从最初的1型进化到与其差异较大的2型，以呼吸系统感染损伤为主的犬2型腺病毒又进化到可以感染肠道就是明显证据。所以，犬腺病毒2型必须得被持续的监控下去，这对于更好地研究其致病规律及疾病预防控制具要意义。

单克隆抗体技术自问世的30多年来发展迅猛，目前已被成功地应用于分子生物学、免疫学等许多领域的研究。在兽医学研究领域， 单克隆抗体在疾病的检测和治疗中发挥了重要作用。免疫胶体金试纸条具有快速、准确、特异和灵敏的优点，只需少量检测样品，就能在很短的时间里对样品是否感染做出准确判断，有利于养殖户的早隔离、早治疗，符合基层养殖单位对于疾病快速诊断的要求。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7。

一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10877，保藏日期为2015年5月27日。

本发明的目的之二是提供一株上述杂交瘤细胞株7D7分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体。

本发明的目的之三是提供上述杂交瘤细胞株7D7分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体在制备检测CAV-2病原试剂中的应用，具体表现在以下两个方面：

1、与杂交瘤细胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体用于检测CAV-2病原的免疫胶体金试纸条的制备；

2、与杂交瘤细胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体用于检测CAV-2病原夹心ELISA方法的建立。 

杂交瘤细胞株2C1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10878，保藏日期为2015年5月27日。

本发明将实验室保存的CAV-2病毒接种于MDCK细胞上进行增殖，当80％的细胞出现病变时收获病毒，反复冻融三次，超声30min，12000r/min离心10min，去除细胞碎片及较大的杂质。取上清，4℃，超速28000r/min 5h，取沉淀，用PBS重悬，12000r/min离心10min，取其上清过非连续蔗糖密度梯度(60％-40％-30％)，28000r/min离 心2.5h，取其白色部分，加入大量PBS脱糖，28000r/min离心2.5h，取其沉淀，用1.5ml PBS重悬，最终获得CAV-2纯化的病毒。

ELISA方法检测结果表明：纯化的CAV-2病毒能与CAV-2阳性抗体发生特异性反应，表明其具有良好的抗原性。

取适量纯化的病毒与弗氏佐剂1∶1混合乳化，免疫6周龄BALB/C小鼠，按常规方法取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，用纯化的病毒作为检测抗原，建立间接EL1SA方法对有融合孔的细胞上清液进行检测筛选阳性细胞克隆株，最终得到2株单一的分泌特异性抗体的杂交瘤细胞克隆，分别命名为7D7，2C1。

间接免疫荧光结果表明：7D7杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能特异性识别CAV-2病毒而与MDCK细胞不反应。

本发明制备的7D7与2C1分泌的单克隆抗体的叠加实验结果表明：这两个单克隆抗体为针对CAV-2病毒不同抗原表位的单抗。