[发明专利]一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为Survivin抗原基因得到的重组腺相关病毒载体；所述重组腺相关病毒载体的构建方法包括以下步骤：

1）改建AAV 2型pBR322质粒：使用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将AAV 2型pBR322质粒中的AAV 2型腺相关病毒中的结构基因切除，然后将含有限制性内切酶 EcoR I和 EcoR V酶切位点的核苷酸序列 CGAATTCATGCGATATCGTT插入质粒中，保留两端的TR序列或者在两端的TR序列的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；

2）将启动子插入步骤1）得到的改建的AAV 2型pBR322质粒中，构建携带有启动子的AAV2型pBR322质粒；所述启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子或SV40早期启动子；

3）获取Survivin cDNA；包括以下步骤：31）从Survivin抗原阳性的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；32）以所述总cDNA为模板进行PCR扩增，得到所述Survivin cDNA，其核苷酸序列为：

GCAGAGGTGGCGGCGGCGGCATGGGTGCACCGACGTTGCCCCCTGCCTGGGAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGGCTGCGCCTGCACCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCCACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTCTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAAGGCTCGGAGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATAAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGTTTGAAGAATTAACCCTTGGTGAATTTTTGAAACTGGACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAAATTGCAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAAGAATTTGAGGAAACTGCGAAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGGCTGCCATGGATTGAGGCCTCTGGCCGGAGCTGCCTGGTCCCAGAG；

4）将步骤2）构建的携带有启动子的AAV 2型pBR322质粒和步骤3）得到的SurvivincDNA分别用限制性内切酶MluI和xbaI进行酶切反应，然后进行DNA连接反应，得到携带有启动子和Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体。