[发明专利]一种基于CdTe荧光量子点高通量实时定量PCR的构建

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域的聚合酶链式反应(PCR)扩增的方法，尤其是利用CdTe水溶性量子点动态调控聚合酶活性实现热启动，进而构建高通量实时定量PCR，保证高通量扩增的准确性和特异性。

背景技术

荧光定量PCR（FQ-PCR）是一种将核酸探针技术、PCR技术和荧光共振能量传递技术有机结合的技术，它使传统的PCR技术实现了从定性到定量的飞跃。该技术目前具有如下优点：(1) 特异性好：使用特异性引物对靶序列进行PCR扩增和使用特异性探针对定量分子进行识别，使检测的特异性好、假阳性低；(2) 灵敏度高：综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术和数码显象技术，因此具有较高的灵敏度；(3) 扩增和检测在同一管内进行并一步完成，因此操作简单、安全且自动化程度高；(4) 检测速度快且高通量：可在2-3 h内完成96甚至256个样品的定量分析；(5) 由于其高通量且检测灵敏度高，特别适宜于检验检疫过程中对大量实际样本的同时分析。而在PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，温度低于退火温度时会产生非特异性的产物，因此高通量FQ PCR扩增中，非特异性的产物的扩增及重现性差仍是迫切需要解决的问题。

热启动基因扩增（hot-start PCR）是获得高灵敏度、高特异性基因扩增的一种非常重要的基因扩增技术。热启动PCR技术的目标旨在低温下抑制酶的活性，限制DNA链延伸的进行，而在高温下酶的活性恢复，因而热启动PCR扩增技术很好地抑制了非特异性片段的扩增，提高了PCR反应的特异性及其灵敏度。目前传统的热启动方法有三种，第一种方法是采用人工的方式将PCR反应的一个重要成分，例如Mg²⁺ 、DNA聚合酶或者引物等与PCR的其他组分分离开来，等PCR反应达到变性温度后再将其加入，但是该方法由于需要手动进行，过于烦琐，不适合高通量基因的大量扩增。第二种方法通过对酶修饰，在低温下抑制酶的活性，限制非特异性片段的扩增，从而达到热启动的目的。常常采用的修饰酶的方式有物理隔绝法 、化学修饰法、抗体修饰等。 但是这种通过修饰酶来实现热启动PCR的扩增，常常需要比较苛刻的PCR循环条件，例如比较长的变性时间，容易导致DNA 的脱嘌呤和断裂，并影响酶的活性和忠实性，而且该方法价格昂贵。第三种方法就是通过对引物或者dNTP进行修饰，但该方法的成功与否很大程度上取决于dNTP或者引物修饰的程度，因而该技术目前未得到人们的广泛亲籁及应用。而且目前市售的含有热启动酶的PCR反应预混液虽可应用于高通量FQ PCR，但其价格昂贵。我们发现荧光量子点可以动态调节普通PCR中聚合酶的活性从而实现“类似热启动”的高效DNA体外复制过程。在本专利中我们将该热启动技术应用于实时定量PCR，从而构建基于荧光量子点的高通量实时定量PCR。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种简单、高效、特异性性强的高通量实时定量PCR，降低成本，构建基于CdTe荧光量子点的高通量实时定量PCR。

基于CdTe量子点的高通量实时定量PCR是通过以下技术方案来实现的：

1）基于CdTe量子点的热启动对于扩增质粒为模板的实时定量PCR扩增中的应用。所述量子点是水相合成的量子点；所述质粒是自制的质粒；荧光染料采用EvaGreen；PCR混合液50 ^oC温浴1h再进行扩增；所述作用是对实时定量PCR扩增的产物特异性增强的作用。

2）基于量子点的热启动对于扩增人类基因组模板的二次实时定量扩增的应用。所述量子点是水相合成的量子点；所述基因组是从人体血液中提取的基因组DNA；荧光染料采用EvaGreen；PCR混合液50 ^oC温浴1h再进行扩增；所述作用是对实时定量PCR扩增的产物特异性增强的作用。

3）基于量子点的热启动对于扩增人类基因组模板的二次实时定量扩增的应用。所述量子点是水相合成的量子点；所述基因组是从人体血液中提取的基因组DNA；荧光染料采用SYBR Green I；PCR混合液50 ^oC温浴1h再进行扩增；所述作用是对实时定量PCR扩增的产物特异性增强的作用。

本发明的优点和有益效果是：

1）水相量子点合成方法简单，成本低廉，可以宏量制备。

2）本发明作为纳米技术与生物技术结合的新成果，与已有热启动酶等热启动方法相比，效果明显，成本低，操作简单。

3）基于量子点的热启动高通量实时定量PCR对质粒的模板以及人类基因组的模板都具有明显热启动效果，即表明其对模板的序列无选择性。