[发明专利]由杂交瘤细胞系分泌的抗Ki67单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种可以识别人Ki67蛋白质分子的单克隆抗体及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞核内Ki67分子的单克隆抗体，对该抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中Ki67的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。

背景技术

Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可缺少，但其确切机制尚不清楚，Ki67作为标记细胞增殖状态的抗原，阳性说明癌细胞增殖活跃。

作为一种存在于增殖细胞中的核抗原，Ki67的确切功能目前尚不清楚，但通过研究它的表达及在核内分布的情况，认为它的功能与染色质相连与细胞有丝分裂有关，因此是目前应用最广泛的增殖细胞标记之一。Gerdes等研究表明Ki67免疫的反应与细胞周期密切相关，在G1、S、G2、M期均表达，但G0期无表达，而且还发现Ki67在G1晚期/S早期微量表达，S期聚集，尤其在后半期表达率明显增高，有丝分裂后期迅速降解或失去抗原决定簇，故认为Ki67是检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标之一。目前有研究表明在多种实体恶性肿瘤中Ki67的表达远高于正常组织，并与恶性肿瘤的发展，转移及预后有关。国外有报道Ki67在乳腺癌组织中阳性率为78.0％。有报道Ki67的表达与乳腺癌肿瘤的生长和浸润以及淋巴结转移之间存在着密切相关性，即Ki67表达阳性的乳腺癌肿瘤细胞的恶性程度大，细胞增殖活跃，因此肿瘤生长速度快，侵袭性大，转移的机会高，预后差。但其机制目前尚不清楚。关于乳腺癌组织中Ki67表达对于乳腺癌的预后判断以及指导治疗价值有待进一步研究，但近来有文献报道Ki67可作为乳腺癌化疗敏感性指标，肿瘤细胞增殖率降低，比肿瘤的肿块缩小更能反映肿瘤对化疗敏感程度，而且还有研究表明Ki67的表达比T分期能更好预测肿瘤的放射敏感性。应用免疫组化技术检测乳腺癌组织中多项生物指标简单、易行，为乳腺癌患者的临床评估提供参考，并有助于临床个体化治疗。Ki67与PCNA这类增殖标记及c-erbB-2、p53等一同被列为仅次于激素受体、组织学级别的乳腺癌第二类预后指标，由于Ki67 在G0 期以外各增殖周期均有表达，更具可用性。两者具有一定的互补性。Ki-67在低分化腺癌组织中的表达较在中高分化腺癌组织的表达明显升高，表明Ki67 染色阳性程度与组织学分级的相关性。表明Ki67表达与乳腺癌发生、发展有关，是一个不良预后因素，对乳腺癌的诊断治疗及预后评价有重要的参考价值。与Ki67不同的是，PCNA的表达可能是DNA多倍体形式表达的一个标记，也成为肿瘤细胞失调状态下的一个标记，检测PCNA可以评价肿瘤细胞增殖状态，也有研究显示PCNA与某些肿瘤的预后及诊断有一定关系。在乳腺癌的预后研究中，PCNA在肿瘤的良恶性的区分、恶性程度的确定及评估预后等方面有较广泛的应用。

Ki67抗原是目前多种恶性肿瘤尤其是乳腺癌研究中的热门生物指标，可以通过对抗原的检测，了解恶性肿瘤的细胞增殖活性。公开号为CN 101896819 A的发明专利“对癌症的诊断测试、预测测试和预后测试”的发明专利描述了一种利用孪蛋白、Aurora A、Plk1、Ki67 和H3S10ph几种蛋白标志物，采用点印迹分析、狭线印迹分析、RIA、肽微阵列和ELISA方法进行肿瘤预后评估的方法。申请号为CN201110088864的发明专利“蛋白组合物及其在制备肺癌诊断试剂盒中的应用”则公开了一种利用p53、p63、Ki67、MCM7及EGFR五种蛋白的组合物配体，如单克隆抗体对肺癌进行诊断的方法。

目前在肿瘤诊断中使用最多的Ki67抗体为克隆号MIB1的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供由杂交瘤细胞系分泌抗Ki67单克隆抗体及其应用。提供一种设计和制备Ki67抗原肽的方法，该抗原由Ki67分子中具有特征性序列的多肽经化学合成后与载体蛋白偶联制备而来。本发明的第二个目的是提供一种特异性好，亲和力高的Ki67单克隆抗体的制备方法，该抗体能特异结合Ki67重组抗原和天然抗原。本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测的使用方法。

所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系73043-24E8，已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路一号院3号，保藏号为CGMCC No.10402。