[发明专利]一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定

权利要求书

1. 一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备微囊藻毒素粗品：取天然水华的新鲜蓝藻5-10g，置于碾钵中研碎后加提取溶剂，放入磁力搅拌器中搅碎1-2h，离心，取上清液；取滤渣重复萃取3-5次，合并上清液，采用0.45um微孔滤膜过滤，将滤液采用PH调节剂调节PH至7.5-8后经0.45um微孔滤膜过滤，在30-60℃条件下蒸发浓缩，再将浓缩液采用0.45um微孔滤膜过滤，制得微囊藻毒素粗品；

（2）采用C18固相萃取柱进行洗脱制备微囊藻毒素纯品：将步骤（1）中制得的微囊藻毒素粗品，上样，先用20-50ml蒸馏水洗脱，再用20-50ml 20-35%的甲醇洗脱，最后用 40-60ml  40-80%的甲醇洗脱，利用柱层析系统分离、纯化，将纯化液移至玻璃定量管中，常温下离心，取上清液旋转蒸发蒸干溶剂，制得微囊藻毒素产品；

（3）微囊藻毒素的测定：采用微囊藻毒素检测试剂盒检测步骤（2）中制备的微囊藻毒素产品，将太湖腐烂的水华上清液添加于基础培养基中，28-30℃恒温培养，连续富集培养3次，根据菌落性状不同进行分离纯化；

（4）采用基因组提取试剂盒对提取菌株基因组DNA，进行PCR扩增，将所有菌株的16SrRNA基因通过软件比对，采用最大似然法与最大简约法构建系统发育树，并对基因序列采用Blast录入，观察该菌株所在分支，判断筛选菌株与已知菌株亲缘关系，并将该菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中培养，培养温度为25-40℃，Ph为7-8，观察该菌株生理生化特性，根据筛选菌株与已知菌株亲缘关系及其生理生化特性对该菌株进行鉴定；

（5）观察筛选菌株对微囊藻毒素的降解能力：将筛选菌株与恶臭假单胞菌接种至底物为初始浓度为15.4ng/L的M9培养基中，连续5d每24h取样1次，上清液以微孔滤膜过滤后，测定微囊藻毒素含量。

2.根据权利要求1所述的 一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,其特征在于，步骤（1）中所述的磁力搅拌的速度为2000-2500r/min。

3.根据权利要求1所述的 一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,其特征在于，步骤（1）中所述的提取溶剂选自50-80%的甲醇水溶液或酸溶液中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的 一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,其特征在于，所述的酸溶液选自2-5%的的甲酸溶液、2-5%的乙酸溶液或5-10%的三氯乙酸中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的 一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,其特征在于，所述的提取液为体积比为（30-40）：（60-70）的5%的乙酸溶液与80%的甲醇水溶液。

6.根据权利要求1所述的 一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,其特征在于，步骤（1）与步骤（2）中所述的离心速度为10000-12000r/min，离心时间为20-30min。

7.根据权利要求1所述的 一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,其特征在于，步骤（3）中所述的基础培养基为添加了1-3mg/L的微囊藻毒素的培养基。

8.根据权利要求1所述的 一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,其特征在于，步骤（2）中所述的柱层析系统参数为：层析柱直径2-4cm，长20-40cm，填料为15-20umC18硅胶，流动相为体积比为（30-45）:（50-60）:（0.03-0.12）的水、甲醇及乙酸；流速为2-5ml/min; 进样体积为2-5ml。

9.根据权利要求1所述的 一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,其特征在于，步骤（3）中所述的富集培养3次后的培养基中微囊藻毒素浓度依次为5-10 mg/L、10-20 mg/L、20-40 mg/L。

10.根据权利要求1所述的    一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,其特征在于，步骤（4）中所述的PCR引物采用细菌通用引物，所述的PCR反应条件为：94℃预变性 5 min , 94℃变性 30 s , 55℃退火 30 s , 72℃延伸 45 s , 38个循环, 最后 72℃延伸10 min , 4℃保存；反应结束后, 取 5μL 反应液经1. 2%琼脂糖电泳 , EB 染色 ,紫外检测。