[发明专利]一种枯草芽孢杆菌喷雾剂及其应用

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由85～94％的营养液、5～10％的甘油和1～5％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为3～5mg/mL、营养液中氮源浓度为10～13mg/mL、营养液中无机盐浓度为0.05～0.1mg/mL；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：(2～3)：(2～3)的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。

2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的无机盐是由质量百分含量为0.05％的氯化钙水溶液、质量百分含量为0.05％的氯化锰水溶液、质量百分含量为0.1％的硫酸镁水溶液和质量百分含量为0.2％的磷酸氢二钠水溶液按等比例混合而成。

3.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：2：2的比例组成。

4.根据权利要求1或3所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的芦荟多糖的提取是按以下步骤进行：

一、芦荟前处理：取新鲜库拉索芦荟叶洗净去刺，横切成5mm薄片架在培养皿上，用鼓风干燥箱55℃的条件下烘干12h，然后将烘干的芦荟叶放入粉碎机粉碎，得到芦荟粉，置于棕色试剂瓶密封保存备用；

二、按质量体积比为1:30g/mL的比例将芦荟干粉放入蒸馏水中，复水30min后用超声波辅助进行提取，然后8000r/min离心15min，取上清液，再放入旋转发仪在0.085MPa，65℃的条件下浓缩至原体积的1/2～1/3，然后加入4倍体积的无水乙醇再置于4℃冰箱，静置过夜，然后2500r/min离心10min，取沉淀，即完成。

5.根据权利要求1或3所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的薄荷多糖是按以下步骤制备的：

一、称取干燥的薄荷药材，粉碎后过40目～60目筛，得到薄荷粉末；将薄荷粉末加入到蒸馏水中浸泡12h～20h，再加热回流提取1h～2h，得到混合物A；向混合物A中加入纤维素酶，调节pH值至5～6，再在温度为40℃～55℃、pH值为5～6的条件下酶解0.5h～3h，得到纤维素酶水解后的混合物A；

步骤一中所述的纤维素酶的加入量与混合物A的质量比为(0.3～1.5):100；

二、向纤维素酶水解后的混合物A中加入蛋白酶和菠萝蛋白酶，调节pH至7～7.5，再在温度为55℃～60℃下酶解0.5h～3h，得到提取液；

步骤二中所述的蛋白酶的加入量与纤维素酶水解后的混合物A的质量比为(0.3～0.8):100；步骤二中所述的菠萝蛋白酶的加入量与纤维素酶水解后的混合物A的质量比为(0.3～0.6):100；

三、使用旋转蒸发仪在温度为62℃～68℃下将提取液的体积减压浓缩至原体积的1/2～1/3，得到浓缩液；向浓缩液中加入无水乙醇，再在室温下静置8h～16h，再进行抽滤，得到沉淀物质；依次使用无水乙醇、无水乙醚和丙酮洗涤对沉淀物质分别清洗3次～5次，再在零下15℃～30℃，冷冻干燥5h～10h，得到薄荷多糖；

步骤三中所述的浓缩液的体积与无水乙醇的体积比为1:(4～6)。

6.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌是按照以下步骤进行优化培养的：

一、取枯草芽孢杆菌接种于LB固体斜面培养基上，在37℃条件下，培养18～20h；

二、取步骤一培养至第2～3代的枯草芽孢杆菌的菌种接种于LB液体培养基中，在温度为37℃、转速为200rpm的条件下培养12～14h；

三、取步骤二培养的枯草芽孢杆菌液接种至含有质量百分含量为0.009～0.08％的氯化钙和质量百分含量为0.01～0.07％的氯化锰的LB液体培养基中，在培养温度为37℃、转速为200rpm、pH为7.2～7.4、通气比例为1:1的条件下培养20h，然后将培养温度降至15℃～20℃继续培养60h，即完成所述的枯草芽孢杆菌的优化。

7.根据权利要求1或6所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌为BS224菌株。