[发明专利]Myf6启动子驱动肌肉组织MyoD基因的表达应用

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及Myf6启动子驱动肌肉组织MyoD基因的表达应用。

背景技术

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。RNA聚合酶和转录因子可以识别并结合启动子上特定DNA序列，从而起始转录(Landolinetal2010)。随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件(李珊珊等，2005)。

转基因技术始于20世纪70年代,是科研人员按照需要将外源目的基因导入宿主细胞中,使外源基因稳定地整合在宿主基因组中，随着宿主基因组的复制而扩增，得到稳定的遗传和表达。原核显微注射法是将在体外构建的目的基因在显微操作仪下用极细的微吸管直接注射到处于原核时期的受精卵的原核中，当受体受精卵在进行DNA合成或修复时，把外源基因整合到基因组中。科学家曾成功地将小鼠的启动子与大鼠的生长激素基因用原核显微注射的方法构建了转基因“超级鼠”，显示了转基因动物技术人为改造物种或生物性状的可能性(Palmiteretal,1982)。有研究表明，外源基因在转基因小鼠中可以稳定的传至第七代(Wangetal,2009)。

中国是猪肉生产和消费大国，猪肉的消费约占肉类消费的64％，因此，优良猪品种的培育对养殖业的发展具有重要意义。常规育种技术曾在猪的品种改良方面发挥了巨大作用，但是存在选择周期长、遗传进展较慢等不足。现代动物分子育种中，利用分子标记技术可以对动物后代进行快捷可靠地筛选(魏景亮等2014)。但是，其改良的程度依然受限于品种自身已有的基因。利用转基因技术可直接对受体动物的基因组进行遗传修饰，从而创造出新性状或新品种。因此，转基因技术与常规育种相结合，是今后优质猪种培育发展的方向。

本发明是基于华中农业大学申请的公开号为103421781A，名称为(猪肌肉组织特异性表达基因myf6启动子及应用)基础上的后续研究。本发明通过构建真核表达载体pSV40-Myf6-MyoDEGFP-N1并将其进行线性化处理，所述的线性化载体片段包括:猪肌肉组织特异性基因Myf6的启动子、猪肌肉组织特异性基因MyoD、标签基因EGFP、SV40polyA序列、SV40增强子序列。真核表达载体pSV40-Myf6-MyoDEGFP-N1的构建流程如图1，线性化片段的序列见附录，线性化的外源基因利用原核显微注射技术制备转基因小鼠。

到目前为止，关于猪肌肉组织特异性基因Myf6的启动子(本文简称为Myf6启动子)，驱动猪的肌肉组织特异性基因MyoD的表达在模式动物小鼠中的研究并未发表过。所以申请人在转基因鼠活体水平上验证猪肌肉组织特异性基因Myf6的启动子是否可以驱使猪的肌肉组织特异性基因MyoD的上调表达，从而影响肌纤维的生长状况。期望通过活体水平验证猪的肌肉组织特异性基因Myf6的启动子活性，为日后生产中制备转基因猪提供功能性启动子，从而为提高猪的瘦肉率提供技术基础。

发明内容

本发明的目的在于利用Myf6启动子驱动肌肉组织MyoD基因的表达应用。本发明通过制备转基因小鼠，对来源于猪肌肉组织特异性基因Myf6的启动子是否可以驱动猪的肌肉组织特异性基因MyoD的上调表达在活体水平上进行了相关生物学验证，旨在获得具有活性的猪肌肉组织特异性启动子，为以后制备转基因猪，提高猪的瘦肉率提供技术基础。

申请人通过在转基因小鼠活体水平上验证猪肌肉组织特异性基因Myf6的启动子活性，获得的结果表明Myf6启动子虽然没有驱使转基因鼠骨骼肌中MyoD基因的上调表达，但是通过对转基因鼠不同组织表达谱的构建表明MyoD基因是在肌肉组织中特异性高表达，并且可以改变转基因鼠的肌纤维的生长状况，使肌束的面积和直径都显著高于野生型鼠，其单位面积内肌纤维数量显著低于野生型鼠。本发明最终获得功能性猪肌肉组织特异性启动子Myf6，为日后生产中制备转基因猪提供了功能性启动子。

具体地，本发明通过以下技术方案实现：