[发明专利]一种含葡萄糖异构酶细胞的固定化方法

说明书

本发明公开了一种含葡萄糖异构酶细胞的固定化方法，所述方法是将含葡萄糖异构酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入缓冲液中，制成菌悬液；向菌悬液中添加载体，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，然后加入戊二醛进行交联，0～30℃搅拌交联1～2h后，过滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒，得含葡萄糖异构酶的固定化葡萄糖异构酶细胞；本发明所提供的固定化方法具有固定化材料成本低，操作简单，机械强度高，在高温条件下较稳定，制备的固定化产葡萄糖异构酶重组大肠杆菌全细胞用于高温条件下催化D‑葡萄糖生产D‑果糖，在85℃的条件下，转化率高达54％，重复使用10批次后，仍具有90％以上的酶活，具有良好的工业化应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种细胞的固定化方法，特别涉及一种含葡萄糖异构酶细胞的固定化方法。

(二)背景技术

葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，GI)，又称木糖异构酶，可以催化D-葡萄糖生成D-果糖，是食品工业中以淀粉为原料生产高果糖浆(High fructose corn syrup，HFCS)的关键酶之一。HFCS是一种天然食品添加剂(甜味剂)，被广泛应用于食品、饮料行业。每年，世界上生产的HFCS就有千万吨，人们对HFCS日益增长的需求和HFCS产业的蓬勃发展，推动了对GI的深入研究和固定化GI技术的飞速发展。何家明等(何家明等，申请号85100412)用大孔强碱性苯乙烯系季氨基阴离子交换树脂吸附发酵液中的酶，制备固定化GI。曹龙奎等(曹龙奎等，申请号200910073264.9)利用磁性壳聚糖复合微球制备固定化GI；吴敬等(吴敬等，申请号201210581801.2)利用壳聚糖絮凝菌体，戊二醛交联絮凝物的方法制备固定化GI。

目前，Genencor/DuPont和Novozymes A/S两家公司生产的固定化GI酶制剂占据市场的主导地位，其固定化方法均是使用戊二醛交联细胞的方法。Novozymes A/S是使用戊二醛交联匀浆细胞，结合使用阳离子絮凝剂(如壳聚糖)、无机载体；Genencor/DuPont使用聚乙烯亚胺和戊二醛结合，并混合无机载体如膨润土、高岭土、硅藻土等。他们制备的固定化GI性质十分稳定，在工业生产条件下，可以使用半年到一年之久。我国固定化GI完全依赖进口，造成我国HFCS生产成本过高，竞争力减弱。

在生产HFCS转化率较低，只能获得果糖浓度为42％的HFCS，想要得到高果糖浓度的糖浆只有经过分离浓缩。异构化反应平衡随温度升高向果糖方向移动，如果GI在90～95℃依然稳定，则有可能直接生成果糖浓度为55％HFCS。

因此，研究一种成本低，在高温条件下转化率高、热稳定性好且可实现工业化生产的GI的固定化方法具有非常重要的现实意义。

(三)发明内容

本发明目的在于克服GI催化生产高果糖浆转化率低等问题，提供了一种提高果糖转化率的含GI细胞的固定化颗粒及固定化方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种含葡萄糖异构酶(GI)细胞的固定化方法，所述方法为：将含GI基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入缓冲液中，制成菌悬液；向菌悬液中添加硅藻土，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，然后加入戊二醛进行交联，0～30℃(优选20～25℃)搅拌交联1～2h后，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5～2mm)，得含GI细胞的固定化颗粒；所述硅藻土与菌悬液中湿菌体重量比为0.01～0.1：1。

进一步，所述GI基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述缓冲液为pH＝6.0～7.5、50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液或pH＝6.0～7.5、50mM Tris-HCl缓冲液。