[发明专利]一种提高植物抗逆性的方法及其应用在审
申请号: | 201510350056.4 | 申请日: | 2015-06-23 |
公开(公告)号: | CN104878042A | 公开(公告)日: | 2015-09-02 |
发明(设计)人: | 李文滨;李永光;王英琪 | 申请(专利权)人: | 东北农业大学 |
主分类号: | C12N15/84 | 分类号: | C12N15/84;A01H5/00 |
代理公司: | 北京爱普纳杰专利代理事务所(特殊普通合伙) 11419 | 代理人: | 张勇 |
地址: | 150030 黑龙*** | 国省代码: | 黑龙江;23 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 提高 植物 抗逆性 方法 及其 应用 | ||
1.一种提高植物抗逆性的方法,其特征在于,通过PCR扩增获得抗逆基因后,构建植物表达载体,再将植物表达载体转化到农杆菌上,再利用含有表达载体的农杆菌侵染目标植物,培育被侵染的目标植物至获得转抗逆基因的种子。
2.权利要求1所述方法,其特征在于,步骤如下:
1)提取大豆子叶总RNA,反转录后获得cDNA,并以所得cDNA为模板,进行PCR扩增,获得抗逆基因;
2)将步骤1)所扩增的抗逆基因插入到质粒载体上获得植物表达载体;
3)再将步骤2)所得的植物表达载体转化到农杆菌上,获得农杆菌转化子;
4)利用步骤3)所得的农杆菌转化子侵染目标植物,获得侵染植物;
5)培育侵染植物至获得含有抗逆基因的种子。
3.权利要求2所述方法,其特征在于,步骤1)所述大豆,品种为东农50;所述抗逆基因,抗逆基因GmAKT1,GeneBank登陆号为KM491715.1。
4.权利要求2所述方法,其特征在于,步骤1)所述PCR扩增,所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所示;扩增条件为:94℃2min;再进行38个循环,其中每个循环降0.2℃:98℃10s,58℃30s,68℃3min;68℃终延伸10min。
5.权利要求2所述方法,其特征在于,步骤2)所述质粒载体,是质粒载体pCXSN。
6.权利要求2所述方法,其特征在于,步骤3)所述将植物表达载体转化到农杆菌上,是将植物表达载体通过冻融法转化到根瘤农杆菌EHA105中。
7.权利要求2所述方法,其特征在于,步骤4)所述目标植物为拟南芥或大豆,侵染部位为花絮;所述侵染是将拟南芥的花絮浸入到转化液中28-32s。
8.权利要求7所述方法,其特征在于,所述转化液,是将农杆菌转化子在室温5000rpm下离心10min后,再将沉淀菌液悬浮在1/2MS缓冲液中,加入表面活性剂SilwetL-77制得。
9.权利要求2所述方法,其特征在于,具体步骤如下:
1)提取东农50大豆子叶的总RNA,反转录获得cDNA后,以所得cDNA为模板,以如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为引物,进行PCR扩增,扩增条件为:94℃2min;再进行38个循环,其中每个循环降0.2℃:98℃10s,58℃30s,68℃3min;68℃终延伸10min,获得抗逆基因GmAKT 1扩增产物;
2)通过XcmI和Hind III的酶切作用将步骤1)所得的抗逆基因GmAKT 1扩增产物连接到质粒载体pCXSN上,获得植物表达载体pCXSN-GmAKT1;
3)通过冻融法将步骤2)所得的植物表达载体pCXSN-GmAKT1转化到根瘤农杆菌EHA105中,获得农杆菌转化子pCXSN-GmAKT1;
4)将步骤3)所得的农杆菌转化子pCXSN-GmAKT1在室温5000rpm下离心10min后,再将沉淀菌液悬浮在1/2MS缓冲液中,加入表面活性剂SilwetL-77制得转化液,将拟南芥的花絮浸入到转化液中30s后取出,获得侵染拟南芥;
5)平放步骤4)所得的侵染拟南芥,避光,保鲜膜包裹保持湿度,暗培养1d后,取出除去遮挡,放入培养箱中培养至获得转抗逆基GmAKT1的拟南芥种子。
10.权利要求1-9所述任一方法,其特征在于,用于农作物转基因育种。
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