[发明专利]一种桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法

权利要求书

1.一种桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)育苗：将桃种子低温砂藏备用；

(2)二龄根结线虫的分离：将感染根结线虫的番茄根打碎，分别过20、100、200、500目网筛，收集500目网筛上的虫卵，通过蔗糖浮选法除杂、浓缩虫卵，将浓缩的虫卵倒于铺有一层200目网筛和两层滤纸的培养皿中，3d后收集二龄根结线虫；

(3)23％Pluronic F-127的制备：称23gPluronic F-127加入80ml 4℃预冷的无菌水，适当搅拌，放于4℃冰箱中融化；

(4)接种：采用6孔细胞培养板，每孔中加入5ml 23％Pluronic F-127和500条二龄根结线虫混匀，在胶将要凝固时将桃幼苗根置于孔中，保鲜膜包裹保湿培养；

(5)染色：在接种30h后取根尖采用次氯酸钠-酸性品红-甘油法染色，染色后压片；

(6)统计鉴定：显微镜下统计线虫数量，根据侵染数量界定植物的抗病性。

2.根据权利要求1所述的桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，所述桃种子低温砂藏3-4个月后发芽，接种时取出。

3.根据权利要求1所述的桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，在所述步骤(2)中收集的虫卵经3000r/min离心3min弃部分上清增加虫卵浓度，显微镜下计算线虫浓度，达到每100μl 100条，分离后当天接种。

4.根据权利要求1所述的桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，在所述步骤(3)中Pluronic F-127是一种共聚物，其23％水溶液在15℃以下为液态，以上为固态，根结线虫在其中自由移动，且无毒性。

5.根据权利要求1所述的桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，在所述步骤(5)中取根尖后，将植株根系插入23％Pluronic F-127中，仍能存活长出侧根，用于移栽。

6.根据权利要求1所述的桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，在所述步骤(5)中次氯酸钠-酸性品红-甘油法染色过程如下：

1)洗净根，取长为1.5cm的根尖放于盛有50ml自来水的烧杯中，加入次氯酸钠至1.5％，处理4-6min，适当搅拌；

2)根尖用自来水冲洗30-45s，后浸泡在自来水中15min，去除残留的次氯酸钠；

3)根尖用滤纸吸干表面水分，然后放于盛有30ml水和1ml染色剂的烧杯中，煮沸30s；

4)冷却至室温，多余的染色剂用流水冲掉，后将根尖放于20-30ml的酸化甘油中，煮沸后冷却；

5)根尖压在载玻片上观察。