[发明专利]一种高效构建人稳定表达细胞株的辅助质粒及其构建方法

权利要求书

1.一种高效构建人稳定表达细胞株的辅助质粒pSpCas9(167T)，其特征在于所述的辅助质粒pSpCas9(167T)是对pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9载体质粒进行了改造，插入针对人基因组上特异性靶位点序列设计的寡核苷酸，该辅助质粒与外源基因共转染时可为外源基因提供167个整合位点，所述的人基因组上特异性靶位点序列如SEQ ID NO.1所示，对应的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的一种高效构建人稳定表达细胞株的辅助质粒pSpCas9(167T)，其特征在于该辅助质粒pSpCas9(167T)在人结肠癌细胞整合效率实验中可以将线性化质粒pCMV-p53-2A-EGFP的整合拷贝数提高2.90倍。

3.根据权利要求1所述的一种高效构建人稳定表达细胞株的辅助质粒pSpCas9(167T)，其特征在于该辅助质粒pSpCas9(167T)在人结肠癌细胞整合效率实验中可以将线性化质粒pCMV-p53-2A-EGFP的整合效率提高8.61倍。

4.根据权利要求1所述的一种高效构建人稳定表达细胞株的辅助质粒pSpCas9(167T)，其特征在于该辅助质粒pSpCas9(167T)在人结肠癌细胞实验，可以将转pCMV-p53-2A-EGFP载体p53蛋白的表达量提高2.94倍。

5.根据权利要求1-4所述的一种高效构建人稳定表达细胞株的辅助质粒pSpCas9(167T)，其特征在于该辅助质粒可以有效在人细胞转基因实验中提高线性化质粒的拷贝数和整合效率。

6.一种如权利要求1所述的高效构建人稳定表达细胞株的辅助质粒pSpCas9(167T)的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒酶切，酶切后产物经琼脂糖电泳回收含有pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9的片段；

(2)设计针对人基因组特异性靶位点序列的寡核苷酸，所述的人基因组特异性靶位点序列如SEQ ID NO.1所示，所述的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

(3)将步骤(2)设计的寡核苷酸连入步骤(1)回收的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9片段中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取生长良好的单克隆，37℃振荡培养过夜，提取质粒。