[发明专利]一种柯萨奇病毒A6型核酸的检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种核酸检测试剂盒，具体涉及一种快速柯萨奇病毒A6型的实时荧光定量逆转录PCR检测试剂盒，可应用于公共卫生单位和临床医疗单位，以对柯萨奇病毒A6型引起的手足口病暴发疫情、聚集性病例和临床病例进行快速、定性或定量检验。

背景技术

手足口病是由多种肠道病毒(human enterovirus，HEV)引起的出疹发热性急性传染病，主要感染婴幼儿。该病报道最早见于20世纪50年代末，并分别于1958年、1969年从临床样品中成功分离得到柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型两种病原体。之后数十年中，柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型在世界不同国家和地区交替流行，被认为是手足口病最重要的病原体。但是自2008年起，另一种可以引起手足口病的肠道病毒——柯萨奇病毒A6型，其感染性和致病力突然增强。短短数年间在欧洲(芬兰、法国、西班牙、英国)、东亚(日本、中国台湾)、东南亚(新加坡、泰国)、美洲(美国、古巴)和大洋洲(新西兰)的许多国家和地区引起不同规模的流行，甚至造成较为严重的公共卫生事件。作为手足口病流行较广的中国，近几年来也呈现出病原谱组成发生改变的新情况。如2011年深圳市数据显示，柯萨奇病毒A6型已取代柯萨奇病毒A16型，成为该市手足口病排名第二位的病原体。2012年，湖北十堰、福建福州等多地的柯萨奇病毒A6型感染均上升明显，也成为当地手足口病最主要的病原体之一。2013年初，北京、西安、河南、江苏、广东以及全国多地柯萨奇病毒A6型感染在短时间内急剧上升，首次出现全国范围内的柯萨奇病毒A6型手足口疫情。综合国内外情况，柯萨奇病毒A6型极有可能稳定地成为手足口病主要病原体，在未来与肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型长期并存，交替流行，改变手足口病流行的既有规律。因此，开展对柯萨奇病毒A6型肠道病毒的日常监测和临床检验已十分必要。

长久以来实验室对柯萨奇病毒A6型的鉴定多采用对病毒基因扩增后测序的方式实现，显然不适合应用在大量样品的日常筛检以及突发公共卫生事件的快速检验之中。近期有个别品牌的同时检测柯萨奇病毒A6型和其它某型肠道病毒的双通道检测试剂产品面世。虽然提供了一种检测方法，但是因其是双通道产品，成本较高，应用在柯萨奇病毒A6型的专项检测工作时，存在严重浪费的情况。因此建立一套成熟、稳定、经济的，专门针对柯萨奇病毒A6型肠道病毒检测的方法，以满足疾控机构和医疗单位开展柯萨奇病毒A6型的日常监测和应急检验需求，为新形势下手足口病防控提供技术支持。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种柯萨奇病毒A6型的核酸检测试剂盒及检测方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒，包括：柯萨奇病毒A6正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述柯萨奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述柯萨奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED640中的任一种，荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任一种。

在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括实时荧光PCR反应液、逆转录体系、柯萨奇病毒A6型标准品和DEPC处理水中至少一种。

在一些实施方案中，所述实时荧光PCR反应液由PCR缓冲液、耐热Taq DNA聚合酶、硫酸镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物组成。

在一些实施方案中，所述逆转录体系由MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂和随机引物组成。

在一些实施方案中，柯萨奇病毒A6型标准品为含有柯萨奇病毒A6型VP1基因部分序列的阳性质粒。

在一些优选实施方案中，所述含有柯萨奇病毒A6型VP1基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。