[发明专利]鉴别气溶胶中布鲁氏菌A19疫苗株的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测技术(Recombinase Polymerase Amplification and Lateral Flow Dipstick，RPA-LFD)快速鉴别诊断气溶胶等临床样本中布鲁氏菌A19疫苗株的引物与探针以及试剂盒。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌(主要为牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌等)引起的人和多种家畜共患的传染病，也是我国法定检疫和净化的重要病原。近年来发病率呈现逐年上升趋势，尤其是对奶畜危害极大，流产率高达50％-80％，乳、肉产量减少10％-20％。据《兽医公报》统计，2013年全国共发生布鲁氏菌病3620次，42720头牛羊发病。因此，布鲁氏菌病给社会经济发展与稳定、国家公共卫生安全等构成严重威胁。

布鲁氏菌病的传染源主要是患病动物及带菌者，它们通过分泌物、乳汁、体液等将布鲁氏菌排出体外，污染环境，同时布鲁氏菌粘附在空气中的灰尘悬浮粒子上，形成气溶胶进而传播，感染其他动物和人。养殖场环境中的布鲁氏菌气溶胶的分布可造成布鲁氏菌病的传染与流行，给畜牧业生产和人类健康带来严重危害，尤其是当前集约化、高密度养殖环境下更容易形成布鲁氏菌气溶胶性的流行。因此，通过监测养殖场环境中布鲁氏菌气溶胶，可以有效地预警预报布鲁氏菌病的暴发与流行。

我国动物布鲁氏菌病防控的主要策略是检疫与净化。目前我国牛群免疫常用的牛种布鲁氏菌A19活疫苗株在抗原与抗体的诊断上会对布鲁氏菌病野毒感染造成干扰。这是因为我国目前使用的布鲁氏菌病诊断方法不能对自然感染和人工疫苗免疫进行鉴别诊断，必然导致一些自然感染的病畜逃避检疫，使患病动物长期存在，对牛群和人类的安全长期构成威胁，因此，我国很难实行布鲁氏菌病的检疫、扑杀、净化的防控规程。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌A19疫苗株的引物、探针及试剂盒，该试剂盒能够特异、灵敏、简易、快速的现场鉴别诊断气溶胶中布鲁氏菌A19疫苗株。

为实现本发明目的，采用如下技术方案：

一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌A19疫苗株的引物对和探针组合，其中Brucella-RPA-LFD正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示；A19-RPA-LFD正向引物序列如SEQIDNo.4所示，反向引物序列如SEQIDNo.5所示，探针序列如SEQIDNo.6所示。

本发明还提供了一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌A19疫苗株的试剂盒，该试剂盒包含上述引物对与探针组合。

本发明进一步提供了一种用于快速鉴别诊断气溶胶样本中布鲁氏菌A19疫苗株的方法，包括如下步骤：

(1)检测样本DNA的提取或检测样本裂解处理；

(2)以步骤(1)中处理的样本为模板，进行RPA扩增；

(3)用侧流层析试纸条检测上述RPA扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有布鲁氏菌A19疫苗株。

优选的是，步骤(2)中所述RPA扩增体系为：RPA反应体系为50μL：其中包括2.1μL 10μM的正向引物，2.1μL 10μM的反向引物，0.6μL 10μM的探针，rehydration缓冲液29.5μL，待测样本DNA或粗裂解产物2μL，ddH₂O 11.2μL；将上述47.5μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液2.5μL，上下颠倒混匀后于恒温水浴38℃反应20-30分钟。

优选的是，步骤(3)的具体步骤为：每个取RPA反应产物取2μL与98μL PBST试纸条检测缓冲液(1×PBS+0.1％吐温20)混合，将一个测流层析试纸条(LFD)浸入，5min之内观察结果，若Brucella-RPA-LFD与A19-RPA-LFD两个检测组合同时出现检测条带和对照条带，则该样品中布鲁氏菌A19疫苗株阳性；Brucella-RPA-LFD检测组出现检测条带和对照条带，而A19-RPA-LFD检测组仅出现对照条带，则说明该样品中含有布鲁氏菌A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌；Brucella-RPA-LFD与A19-RPA-LFD两个检测组均未出现检测条带而同时出现对照条带，则说明检测样本中不含有布鲁氏菌属细菌。出现其他情况则说明RPA-LFD布鲁氏菌A19鉴别检测不成立。